Chemika Examenwiki - Gebruikersbijdragen [nl]

Mechanisms of Signal Transduction and Cell Regulation

2022-02-04T15:56:41Z

R0837412: /* Examenvragen */

[[Categorie: Mabb]]
== Vakinformatie ==
Vak uit de master B&B - cellulaire orientatie. Gedoceerd door 3 proffen: Hideaki Mizuno (vroeger Marc de Ley), Joris Winderickx en Jozef Vanden Broeck.
Er vallen bonuspunten te verdienen tijdens het jaar door powerpoints te presenteren over opgelegde papers.
Bij één van de drie proffen moet je een paper mondeling bespreken. De andere twee hebben elk één vraag die je schriftelijk moet beantwoorden.

EXAMENVRAGEN KOMEN TERUG!

ECTS-fiche: https://onderwijsaanbod.kuleuven.be/syllabi/e/G0G61AE.htm

== Examenvragen ==

===04 February 2022 ===
(no oral discussion of paper due to COVID-19 measures)
# Winderickx: Molecular genetics of red-green colour deficiencies. Why is it so frequent, and why can such apparently similar genotypes lead to different phenotypes. Is tetrachromacy possible? (talk about it)
# Mizuno: Characteristics of NO. Synthesis of NO, explain. Regulation of the different NOS (eNOS, nNOS, iNOS).
# Vanden Broeck: What do you know about GPCR activation? Explain a hypothetical scheme given (from the lectures, the different conformations of GPCR).

===24 January 2022 ===
(no oral discussion of paper due to COVID-19 measures)
# Winderickx: Regulation and function of adenylate cyclase. Give a signaling pathway involving regulation of adenylate cyclase (Ca2+ and calmodulin regulation)
# Mizuno: EF hand motif and C2 domain, structure, how they bind Ca2+, examples of proteins containing one of these and how they transduce signals (EF hand: Calmodulin, SMIT1; C2 domain: classical PKCs, synaptotagmin)
# Vanden Broeck: Give 3 lipid derived signalling molecules, synthesis, function, transduction

===24 January 2021 ===
(no oral discussion of paper due to COVID-19 measures)
# Winderickx: Bcl-2 family, function, classification based on protein domains, schematic representation of pathway in which they operate
# Mizuno: EF hand motif and C2 domain, structure, how they bind Ca2+, examples of proteins containing one of these and how they transduce signals
# Vanden Broeck: 3 examples of function-based assays for GPCR-ligand binding, give (dis)advantages + how can you differentiate between agonists, inverse agonists and competitive antagonists?

===17 January 2021 ===
(no oral discussion of paper due to COVID-19 measures)
# Winderickx : Bcl-2 family, function, classification based on protein domains, schematic representation of pathway in which they operate
# Mizuno: 1) common structures in protein kinases 2) How external activation of classic PKC
# Vanden Broeck: Schematic of Insuline receptor activation and muscle constriction and pathways given, explain the major pathways here and how these cells increase the glucose uptake

===24 August 2020 ===
(no oral discussion of paper due to COVID-19 measures)
# Winderickx : Bcl-2 family, function, classification based on protein domains, schematic representation of pathway in which they operate
# Mizuno: EF hand motif and C2 domain, structure, how they bind Ca2+, examples of proteins containing one of these and how they transduce signals
# Vanden Broeck: 3 examples of function-based assays for GPCR-ligand binding, give (dis)advantages + how can you differentiate between agonists, inverse agonists and competitive antagonists?

===24 January 2020 VM ===
# Winderickx: RGS, GoLoco, AKAPs, Bcl2-family and GPCR desensitization(?)
# Mizuno: ER/SR and calcium uptake - serca, ip3r, ryr, stim and orai1 explanation + How is it regulated
# Vanden Broeck: Paper about GPCR's - question about arrestin

===23 January 2020 VM ===
# Mizuno (oral): Paper about allosteric activation of Raf. What is the P-loop and the catalytic site of a kinase?
# Winderickx: Explain the function of the members of the Bcl2-family. What makes them belong to the same family? Briefly explain the pathway(s) it is involved in and briefly give the function of the other substrates in the pathway(s).
# Vanden Broeck: Give three downstream compounds of the insulin/IGF pathway in detail.

===22 January 2020 VM ===
# Winderickx : Apoptosis, intrinsic, extrinsic pathway
# Mizuno (oral): Paper about kinases
# Vanden Broeck: Lipid derived signalling molecules, synthesis, function, transduction

===21 januari 2020 VM ===
# Winderickx (oral): Summarize the findings of the paper and place this in context of the mechanisms underlying programmed cell death. Prepare for a discussion on this topic. ''FSH1 overexpression triggers apoptosis in S.cerevisiae:'' [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31363875]
# Mizuno
## Explain the structures of the EF-hand motif and the C2 domain. Include an explanation on how these motifs interact with Ca2+.
## Give a few examples of signaling molecules that have one of these motifs and explain how these molecules transduce signals.
# Vanden Broeck: Explain how you would perform a '''ligand binding assay''' for a 7TM/GPCR type of receptor. Specify the different practical steps. Compare this kind of assay with one example of a cell based '''functional receptor assay''' and discuss the possible advantages and disadvantages of each type of assay.
'''
===16 januari 2020 NM===
# VDB (mondeling): paper over insuline receptor
# JW: kleurenblindheid (rood-groen) + verschillende gene arrays maar toch zelfde fenotype?
# MH: Wat is NO? Hoe gemaakt (oxidatie arginine)? Rol als second messenger? Bespreek nNOS, eNOS en iNOS en zijn regulaties

===15 januari 2020 VM===
# Mizuno (mondeling): artikel over SOCE (store operated Ca2+ entry) Neuronal SOCE: myth or reality? (Lu B, Fivaz M, 2016)
## Explain general mechanism of SOCE, including EF hand, STIM1, Orai1 (3 min talk)
## Explain the paper: difficulties with neuronal cells and how to overcome these problems
# Winderickx: Regulation and function of adenylate cyclase. Give a signaling pathway involving regulation of adenylate cyclase (Ca2+ and calmodulin regulation)
# VDB: Give the three categories of neurochemicals and explain briefly their structural characteristics. Explain in detail the processes in/near the neurochemical synapse.

===24 januari 2019 VM ===
# Mizuno (mondeling): Artikel over Redox signaling: 'Redox signaling during hypoxia in mammalian cells. Review ARTICLE, Smith KA, et al. Redox Biol. 2017 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28595160]
## Explain ROS production (3min talk)
## Explain redox signaling in hypoxia (3 min talk)
# Winderickx: Adenylaat cyclase is important for cAMP signaling. How is it regulated?
# Vanden Broeck: Describe endocrine first messengers and all their categories. Explain in detail with biosynthesis, mode of action and working of insuline.

===23 januari 2019===
# Mizuno: artikel over SOCE
# Winderickx: Kleurenblindheid
# Vdb: Bespreek de belangrijkste groepen van endocriene en neurochemische 1st messengers.

===22 januari 2019===
# mizuno: de rol van stim1 en calmudin bij store operated calcium release. Explain SOCE and how is Stim1 involved?
# Winderickx: had een artikel over metacaspases
# Vdb: How to perform a ligand binding assay of GPCR, a functional receptor assay, examples and what are the advantages of each?

===17 januari 2019===
# Windrickx: artikel over apoptose (en leg dan basically alle pathways uit: intrinsieke, extrinsieke en necropoptose)
# VDB: 3 compounds afgeleid van membrane lipids uitleggen
# Mizuno: algemeen activatiemechanisme van RTKs uitleggen en aantal vb geven van downstream pathways

===16 januari 2019===
#Winderickx: Apoptose (schematisch intrinsiek en extrinsiek geven) + verschil tussen necrose en necroptose en apoptose
#VDB: insuline (welke 3 downregulatie mechanisme)
#Mizuno (mondeling): artikel over ROS: kanker en T-cellen (heel interessant artikel om ROS te leren moest dit een theorievraag zijn!)

===29 januari 2018===
#Winderickx: paper over apoptose
#VDB: insuline
#Mizuno: Wat is het effect van redox op de regulatiemechanisme van EGF receptor

===26 januari 2018===
#Winderickx: kleurenblindheid: genetica en waarom het vooral bij jongens voorkomt
#Mizuno: ROS: productie en invloed op proteïnen
#VDB: paper over GPCR
===25 januari 2018===
#Winderickx: Bcl2 uitleggen en de pathways waarin het voorkomt.
#VDB: 3 compounds afgeleid van membrane lipids uitleggen.
#Mizuno: Paper over ros

===23 januari 2018===
#Winderickx:Leg uit Adenylylcyclase en cAMP, regulatie enzo...
#Van den Broeck:Hoe zou je een binding assay uitvoeren voor een GPCR. Vergelijk dit met een functional assay. wat zijn voor en nadelen van deze technieken.
#Mizuno:Paper over het structurele verschil tussen STIM1 en STIM2. (Specifiek over de SOAR regio)

===18 januari 2018===
#artikel JW over Bax (apoptosis)
#HM: mechanisms van RTKs uitleggen en een pathway verder uitwerken
#JVB: belangrijkste groepen van neurochemische en endocriene 1st messengers

=== 17 januari 2018 ===
# JVB: paper Venus Tyrosine Kinase
# JW: Schematische weergave intrinsieke en extrinsieke pathway + uitleggen wat de belangrijkste componenten zijn en wat ze doen. Kort het verschil uitleggen tussen apoptose, necrose en necroptose.
# HM: explain store operated CA entry. How is this regulated by PKC?

=== 30 januari 2017 ===
#mondeling Winderinckx: artikel over metacaspases en caspases. Vat het artikel samen en leg uit wat het concept te maken heeft met de intrinsieke en extrinsieke apoptose pathway adhv een schema
#Mizuno: Op welke manier kan de EF-hand en het C2 domein Ca binden en welke signalering?
#VDB: 3 lipid derived signaling compounds uitleggen + synthese + hun signalering

=== 27 januari 2017(vm)===

#JVB: paper "Diverse activation pathways in class A GPCRs converge near the G-protein-coupling region" Maak een samenvatting, leg mondeling uit en dan mag je je nog aan enkele vage vragen verwachten.
#JW: Bcl-2 klasse proteïnen, wat is die BH en leg die proteïnen uit in een schema met andere proteïnen die verwant zijn.
#HM: ROS: hoe wordt dat gemaakt en hoe kan dat proteïnen modificeren?

=== 26 januari 2017(vm)===
#Paper Hideaki:
#* STIM, EF hand en calcium uptake/release uitleggen adhv cursus
#* Contents paper vertellen
#* 2 referenties kiezen die interessant zijn en uitleggen waarom je ze gekozen hebt.
# JW: Schematische weergave intrinsieke en extrinsieke pathway + uitleggen wat de belangrijkste componenten zijn en wat ze doen. Kort het verschil uitleggen tussen apoptose, necrose en necroptose.
#JVB: Uitleggen welke groep first messengers belangrijk zijn binnen neurochemische moleculen. Biosynthese, mode of action en nog iets geven met als voorbeeld de amines.
=== 24 januari 2017(vm)===

#JW: moleculaire genetica van kleurenblindheid, waarom lijden zoveel mensen eraan en waarom vertonen mensen met schijnbaar gelijke genen toch een verschillend fenotype
#HM: paper over Cys oxidatie op RTK door ROS. a) algemene kennis + uit paper: RTK en de oxidatie van Cys door ROS. b) paper kort uitleggen. c) Welke zijn 2 belangrijke referenties en waarom.
#JVB: Hoe stel je een ligand binding assay op voor GPCR en specificeer de verschillende stappen. Vergelijk met een cell-based assay en geef voor elk voor en nadelen.

===18 januari 2017 (nm)===

#JW: Artikel i.v.m. BH3 proteïnen in verband met apoptose en autofagie. Geef de intrinsieke en extrensieke pathway van apoptose schematisch weer en breng in verband.
#HM: Hideaki: Leg uit hoe in een cel de lage concentratie aan Calcium kan worden behouden in het cytosol en hoe dit verandert indien er stimuli zijn.
#JVB: Geef 3 componenten die van lipiden zijn afgeleid, leg de regulatie uit en breng in verband met signaaltransductie.

===22 januari 2016 (nm)===
#JW: Paper over kleurenblindheid
#JVB: Bespreek drie componenten van de insuline signaling pathway
#HM: Bespreek de moleculen die instaan voor de calcium steady state in de cel en bespreek de mechanismen om de calciumconcentratie in de cel te verhogen

===14 januari 2016 (nm)===
#JVD: artikel over LGR4
#JW: intrinsic and extrinsic pathway of apoptosis + kort apoptose, necrose en necroptosis vergelijken
#MH: structuur, functie, klassen van NOS + regulatie van blood flow in bloedvaten

===13 januari 2016 (vm)===
#JVD: Paper over lipid signal s1p
#JW: Vraag over kleurenblindheid, genetische oorzaak en algemene uitleg
#HM: Vraag over RTK zowel transmembraan als membranaire/cytosolisch uitleggen + sh2 uitleggen

===24 januari 2014 vm===
#paper for Mizuno
#Van den Broek:
##3 ways to study ligand/ GPCR interactions in a cell
## How can you see the difference between agonist, antagonist and reverse agonist
#Winderickx:
## Give the two apoptosis pathways
## Difference between apoptosis, necrosis and necroptosis

===23 januari 2014 vm===
#paper for Mizuno: review Nature 2012 about EGFR (oral examination)
#Vdb: give 3 examples of important lipid compounds of signaling (written)
#Win: explain the genetic mechanisms behind deutan and protan vision defects + explain why so many people suffer from them (written)

===16 jan 2014 nm ===
#Mizuno: Explain the roles of Ca2+ in muscle contraction.
#Winderickx: Give a schematic overview of the biogenesis of small non-coding RNAs. Explain why non-coding RNAs provide an additional layer of gene expression control.
#Vdb: Paper over metabolisme van 20-hydroxyecdyson en Juvenile Hormone III. Make a brief summary and explain orally.

===28 jan 2013 nm ===
#Win: miRNA, RGS, forskolin, ripoptosoom, IAP
#Vdb: Drie componenten bespreken van de insuline groei factor pathway
#De Ley: artikel over histidine fosforylatie

=== 25 jan 2013 ===
#Winderickx: a) Wat zijn miRNA en piRNA? b) Kleurenblinheid is verbonden met verschillende opsines. Verklaar. Geef ook het moleculair genetisch mechanisme van kleurenblindheid.
#Vdb: Artikel [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3128055/ GPCR oligomers in pharmacology and signaling]
#De Ley: Calcium: gradiÃ«nten, golven, oscillaties en intracellular stores. Bespreek ook de moleculaire mechanismen van calcium-signalling.

=== 20 jan 2012 ===
#Winderickx: paper over een yeast proteine met een BH3 domein en daar wat onderzoeken over welke invloed dat proteine had op apoptose. Vraag derbij was: leg het belang uit van het BH3 domein en geef de pathway die hiermee te maken heeft.
#Vdb: Geef 3 (main) receptortypes en leg hun structuur uit en hoe ze werken en een voorbeeld ervan.
#De ley: Een of andere figuur met een hoop proteines en pathways en dan moest ge uitleggen wat elk proteine was. Dingen die er op stond een RTK met JAK en STAT's en dan nog een pathway van PI3K en een pathway van Sos enz... Beetje vanalles bijeen dus!

=== 19 jan 2012 ===
#Vdb: geef 3 voorbeelden van adaptors bij RTK om hun belang aan te tonen
#Mdl: laatste hoofdstuk pg 3 eerste slide : geef alle omicsen , leg dat figuurke uit en geef uitleg over datamining
#JW: paper: Selective expression of human X chromosome-linked green opsin genes / Vragen: Verklaar waarom deuteranopen veel vaker voorkomen dan protanopen. Hoe kan je nagaan of een hybride gen zich vooraan of verderop bevindt in de opsine array? Klopt het dat vrouwen beter zien dan mannen + waarom? Hoe kan je verklaren dat bij een ééneiige tweeling, het ene meisje wel en het andere meisje geen kleurenblindheid vertoont?

=== 31 jan 2011 nm ===

# Van den Broeck: Geef het belang van lipid-derived componenten in cell signal transduction mbv 3 voorbeelden uit verschillende synthetische pathways. En bespreek de functionele eigenschappen van deze componenten.
# Robben: Geef de moleculaire mechanismen en downstream effecten van cytoplasmatische Calcium-release
# Winderickx: artikel [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1409688 Selective expression of human X chromosome-linked green opsin genes ]

===28 jan 2011 nm ===

# Winderickx: Apoptosis is belangrijk bij de ontwikkeling en differentiatie. Leg uit. En geef de intrinsieke en extrinsieke pathway schematisch.
# Robben: Artikel over tyrosine fosfatases.
# Vandenbroeck: Leg uit waarom adaptorproteinen belangrijk zijn bij receptor tyrosine kinases. Geef 3 voorbeelden en bespreek.

=== 20 jan 2011 nm ===

# artikel van Vandenbroeck: insuline en Glut4 transporter
# Robben: functies van ligand afhankelijk calcium kanalen bespreken
# Winderickx: GAP, GEF, GoLoco, RGS en AKAP en hun rol in signaal transductie

=== 20 jan 2011 vm ===

# Vandenbroeck: Artikel over [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16123234 gonadotrope receptors]
# Robben: MAPKs, organisatie, regulatie, upstream en downstream gebeurtenissen
# Winderickx: regulatie van adenylate cyclase

=== 10 sep 2010 ===

# artikel van Winderickx: [http://dx.doi.org/10.1016/j.semcancer.2006.11.006 Yeast apoptosis - From genes to pathways]
# Robben: MAPKs: organisatie, regulatie, upstream en downstream gebeurtenissen
# Vandenbroeck: Bespreek 3 componenten van de geconserveerde insuline/IGF signaaltransductie-pathway (hun moleculaire eigenschappen en daarmee samenhangende functies)

=== 14 jan 2010 ===

# artikel van Vandenbroeck
# robben: NO synthase en functioneren daarvan
# RGS, caspases (intrinsiek en extrinsiek), GoLoco

=== 14 jan 2010 ===

# artikel van robben,
# vandenbroek: experimenten om receptoren te onderzoeken (reporter gene, aequorin, scintillation, ...)
# Jorix: regulatie van cAMP

=== 28 jan 2009 ===
# MDL: Artikel NAADP
# JW: maak vgl tussen apoptose en necrose en geeft schematisch de intrinsieke en extrinsieke pathway weer
# JVdB: Bespreek 3 componenten uit de insuline signalling. (Ik had Insuline, Insuline receptor en IRS-1 en da was in orde)

=== 22 jan 2009 ===

# De Ley: NO en NO synthase(n)
# Winderickx: AKAP, Go Loco, RGS
# VDB: artikel gonadotrope receptor

=== 29 aug 2008 ===

# Vandenbroeck: Artikel: Insulin signalling in growth control in D. Melanogaster (of iets in die aard)
# Winderickx: Bespreek het verschil tussen necrose en apoptose. Bespreek kort de signaalpaden die instaan voor apoptose.
# Deley: Bespreek het verschil tussen Ser/Thr-kinasen en Tyr-kinasen.

=== 24 jan 2008 ===

# MDL: ROS
# JWX: kleurenblindheid, mol. mechanisme
# VDB: artikel p450 and halloween genes en dan nog wat bijvraagskes.

=== 23 jan 2008 ===

# de ley: his fosforylatie
# vandenbroeck: bespreek 3 componenten van insuline pathway
# winderickx: artikel apoptose breng in verband met de cursus

=== 15 jan 2008 ===

# de ley: calcium: gradiënten, golven en osscillaties
# winderinkx: bespreek apoptose versus necrose en geef intrinsic en extrinsic pathway
# vanden broeck: artikel over boss/sevenless pathway in R7 ontwikkeling bij drosophila

=== 15 jan 2008 ===

# De Ley: artikel over phosphohistidines
# Winderickx: Regulatie van G-proteïnes, plus functie van RGS en GoLoco. Geef verschillende klasses G-proteïnen plus hun effector en second messengers.
# Vanden Broeck: Geef 3 functional assays om G-proteïnen te onderzoeken.
# Bijvragen : Leg uit:
#* Sos
#* Prohormoon Convertase
#* Phosphoinositide-3-kinase

Mechanisms of Signal Transduction and Cell Regulation

2022-01-31T08:48:49Z

R0837412: /* 24 January 2020 VM */

[[Categorie: Mabb]]
== Vakinformatie ==
Vak uit de master B&B - cellulaire orientatie. Gedoceerd door 3 proffen: Hideaki Mizuno (vroeger Marc de Ley), Joris Winderickx en Jozef Vanden Broeck.
Er vallen bonuspunten te verdienen tijdens het jaar door powerpoints te presenteren over opgelegde papers.
Bij één van de drie proffen moet je een paper mondeling bespreken. De andere twee hebben elk één vraag die je schriftelijk moet beantwoorden.

EXAMENVRAGEN KOMEN TERUG!

ECTS-fiche: https://onderwijsaanbod.kuleuven.be/syllabi/e/G0G61AE.htm

== Examenvragen ==

===24 January 2022 ===
(no oral discussion of paper due to COVID-19 measures)
# Winderickx: Regulation and function of adenylate cyclase. Give a signaling pathway involving regulation of adenylate cyclase (Ca2+ and calmodulin regulation)
# Mizuno: EF hand motif and C2 domain, structure, how they bind Ca2+, examples of proteins containing one of these and how they transduce signals (EF hand: Calmodulin, SMIT1; C2 domain: classical PKCs, synaptotagmin)
# Vanden Broeck: Give 3 lipid derived signalling molecules, synthesis, function, transduction

===24 January 2021 ===
(no oral discussion of paper due to COVID-19 measures)
# Winderickx: Bcl-2 family, function, classification based on protein domains, schematic representation of pathway in which they operate
# Mizuno: EF hand motif and C2 domain, structure, how they bind Ca2+, examples of proteins containing one of these and how they transduce signals
# Vanden Broeck: 3 examples of function-based assays for GPCR-ligand binding, give (dis)advantages + how can you differentiate between agonists, inverse agonists and competitive antagonists?

===17 January 2021 ===
(no oral discussion of paper due to COVID-19 measures)
# Winderickx : Bcl-2 family, function, classification based on protein domains, schematic representation of pathway in which they operate
# Mizuno: 1) common structures in protein kinases 2) How external activation of classic PKC
# Vanden Broeck: Schematic of Insuline receptor activation and muscle constriction and pathways given, explain the major pathways here and how these cells increase the glucose uptake

===24 August 2020 ===
(no oral discussion of paper due to COVID-19 measures)
# Winderickx : Bcl-2 family, function, classification based on protein domains, schematic representation of pathway in which they operate
# Mizuno: EF hand motif and C2 domain, structure, how they bind Ca2+, examples of proteins containing one of these and how they transduce signals
# Vanden Broeck: 3 examples of function-based assays for GPCR-ligand binding, give (dis)advantages + how can you differentiate between agonists, inverse agonists and competitive antagonists?

===24 January 2020 VM ===
# Winderickx: RGS, GoLoco, AKAPs, Bcl2-family and GPCR desensitization(?)
# Mizuno: ER/SR and calcium uptake - serca, ip3r, ryr, stim and orai1 explanation + How is it regulated
# Vanden Broeck: Paper about GPCR's - question about arrestin

===23 January 2020 VM ===
# Mizuno (oral): Paper about allosteric activation of Raf. What is the P-loop and the catalytic site of a kinase?
# Winderickx: Explain the function of the members of the Bcl2-family. What makes them belong to the same family? Briefly explain the pathway(s) it is involved in and briefly give the function of the other substrates in the pathway(s).
# Vanden Broeck: Give three downstream compounds of the insulin/IGF pathway in detail.

===22 January 2020 VM ===
# Winderickx : Apoptosis, intrinsic, extrinsic pathway
# Mizuno (oral): Paper about kinases
# Vanden Broeck: Lipid derived signalling molecules, synthesis, function, transduction

===21 januari 2020 VM ===
# Winderickx (oral): Summarize the findings of the paper and place this in context of the mechanisms underlying programmed cell death. Prepare for a discussion on this topic. ''FSH1 overexpression triggers apoptosis in S.cerevisiae:'' [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/31363875]
# Mizuno
## Explain the structures of the EF-hand motif and the C2 domain. Include an explanation on how these motifs interact with Ca2+.
## Give a few examples of signaling molecules that have one of these motifs and explain how these molecules transduce signals.
# Vanden Broeck: Explain how you would perform a '''ligand binding assay''' for a 7TM/GPCR type of receptor. Specify the different practical steps. Compare this kind of assay with one example of a cell based '''functional receptor assay''' and discuss the possible advantages and disadvantages of each type of assay.
'''
===16 januari 2020 NM===
# VDB (mondeling): paper over insuline receptor
# JW: kleurenblindheid (rood-groen) + verschillende gene arrays maar toch zelfde fenotype?
# MH: Wat is NO? Hoe gemaakt (oxidatie arginine)? Rol als second messenger? Bespreek nNOS, eNOS en iNOS en zijn regulaties

===15 januari 2020 VM===
# Mizuno (mondeling): artikel over SOCE (store operated Ca2+ entry) Neuronal SOCE: myth or reality? (Lu B, Fivaz M, 2016)
## Explain general mechanism of SOCE, including EF hand, STIM1, Orai1 (3 min talk)
## Explain the paper: difficulties with neuronal cells and how to overcome these problems
# Winderickx: Regulation and function of adenylate cyclase. Give a signaling pathway involving regulation of adenylate cyclase (Ca2+ and calmodulin regulation)
# VDB: Give the three categories of neurochemicals and explain briefly their structural characteristics. Explain in detail the processes in/near the neurochemical synapse.

===24 januari 2019 VM ===
# Mizuno (mondeling): Artikel over Redox signaling: 'Redox signaling during hypoxia in mammalian cells. Review ARTICLE, Smith KA, et al. Redox Biol. 2017 [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28595160]
## Explain ROS production (3min talk)
## Explain redox signaling in hypoxia (3 min talk)
# Winderickx: Adenylaat cyclase is important for cAMP signaling. How is it regulated?
# Vanden Broeck: Describe endocrine first messengers and all their categories. Explain in detail with biosynthesis, mode of action and working of insuline.

===23 januari 2019===
# Mizuno: artikel over SOCE
# Winderickx: Kleurenblindheid
# Vdb: Bespreek de belangrijkste groepen van endocriene en neurochemische 1st messengers.

===22 januari 2019===
# mizuno: de rol van stim1 en calmudin bij store operated calcium release. Explain SOCE and how is Stim1 involved?
# Winderickx: had een artikel over metacaspases
# Vdb: How to perform a ligand binding assay of GPCR, a functional receptor assay, examples and what are the advantages of each?

===17 januari 2019===
# Windrickx: artikel over apoptose (en leg dan basically alle pathways uit: intrinsieke, extrinsieke en necropoptose)
# VDB: 3 compounds afgeleid van membrane lipids uitleggen
# Mizuno: algemeen activatiemechanisme van RTKs uitleggen en aantal vb geven van downstream pathways

===16 januari 2019===
#Winderickx: Apoptose (schematisch intrinsiek en extrinsiek geven) + verschil tussen necrose en necroptose en apoptose
#VDB: insuline (welke 3 downregulatie mechanisme)
#Mizuno (mondeling): artikel over ROS: kanker en T-cellen (heel interessant artikel om ROS te leren moest dit een theorievraag zijn!)

===29 januari 2018===
#Winderickx: paper over apoptose
#VDB: insuline
#Mizuno: Wat is het effect van redox op de regulatiemechanisme van EGF receptor

===26 januari 2018===
#Winderickx: kleurenblindheid: genetica en waarom het vooral bij jongens voorkomt
#Mizuno: ROS: productie en invloed op proteïnen
#VDB: paper over GPCR
===25 januari 2018===
#Winderickx: Bcl2 uitleggen en de pathways waarin het voorkomt.
#VDB: 3 compounds afgeleid van membrane lipids uitleggen.
#Mizuno: Paper over ros

===23 januari 2018===
#Winderickx:Leg uit Adenylylcyclase en cAMP, regulatie enzo...
#Van den Broeck:Hoe zou je een binding assay uitvoeren voor een GPCR. Vergelijk dit met een functional assay. wat zijn voor en nadelen van deze technieken.
#Mizuno:Paper over het structurele verschil tussen STIM1 en STIM2. (Specifiek over de SOAR regio)

===18 januari 2018===
#artikel JW over Bax (apoptosis)
#HM: mechanisms van RTKs uitleggen en een pathway verder uitwerken
#JVB: belangrijkste groepen van neurochemische en endocriene 1st messengers

=== 17 januari 2018 ===
# JVB: paper Venus Tyrosine Kinase
# JW: Schematische weergave intrinsieke en extrinsieke pathway + uitleggen wat de belangrijkste componenten zijn en wat ze doen. Kort het verschil uitleggen tussen apoptose, necrose en necroptose.
# HM: explain store operated CA entry. How is this regulated by PKC?

=== 30 januari 2017 ===
#mondeling Winderinckx: artikel over metacaspases en caspases. Vat het artikel samen en leg uit wat het concept te maken heeft met de intrinsieke en extrinsieke apoptose pathway adhv een schema
#Mizuno: Op welke manier kan de EF-hand en het C2 domein Ca binden en welke signalering?
#VDB: 3 lipid derived signaling compounds uitleggen + synthese + hun signalering

=== 27 januari 2017(vm)===

#JVB: paper "Diverse activation pathways in class A GPCRs converge near the G-protein-coupling region" Maak een samenvatting, leg mondeling uit en dan mag je je nog aan enkele vage vragen verwachten.
#JW: Bcl-2 klasse proteïnen, wat is die BH en leg die proteïnen uit in een schema met andere proteïnen die verwant zijn.
#HM: ROS: hoe wordt dat gemaakt en hoe kan dat proteïnen modificeren?

=== 26 januari 2017(vm)===
#Paper Hideaki:
#* STIM, EF hand en calcium uptake/release uitleggen adhv cursus
#* Contents paper vertellen
#* 2 referenties kiezen die interessant zijn en uitleggen waarom je ze gekozen hebt.
# JW: Schematische weergave intrinsieke en extrinsieke pathway + uitleggen wat de belangrijkste componenten zijn en wat ze doen. Kort het verschil uitleggen tussen apoptose, necrose en necroptose.
#JVB: Uitleggen welke groep first messengers belangrijk zijn binnen neurochemische moleculen. Biosynthese, mode of action en nog iets geven met als voorbeeld de amines.
=== 24 januari 2017(vm)===

#JW: moleculaire genetica van kleurenblindheid, waarom lijden zoveel mensen eraan en waarom vertonen mensen met schijnbaar gelijke genen toch een verschillend fenotype
#HM: paper over Cys oxidatie op RTK door ROS. a) algemene kennis + uit paper: RTK en de oxidatie van Cys door ROS. b) paper kort uitleggen. c) Welke zijn 2 belangrijke referenties en waarom.
#JVB: Hoe stel je een ligand binding assay op voor GPCR en specificeer de verschillende stappen. Vergelijk met een cell-based assay en geef voor elk voor en nadelen.

===18 januari 2017 (nm)===

#JW: Artikel i.v.m. BH3 proteïnen in verband met apoptose en autofagie. Geef de intrinsieke en extrensieke pathway van apoptose schematisch weer en breng in verband.
#HM: Hideaki: Leg uit hoe in een cel de lage concentratie aan Calcium kan worden behouden in het cytosol en hoe dit verandert indien er stimuli zijn.
#JVB: Geef 3 componenten die van lipiden zijn afgeleid, leg de regulatie uit en breng in verband met signaaltransductie.

===22 januari 2016 (nm)===
#JW: Paper over kleurenblindheid
#JVB: Bespreek drie componenten van de insuline signaling pathway
#HM: Bespreek de moleculen die instaan voor de calcium steady state in de cel en bespreek de mechanismen om de calciumconcentratie in de cel te verhogen

===14 januari 2016 (nm)===
#JVD: artikel over LGR4
#JW: intrinsic and extrinsic pathway of apoptosis + kort apoptose, necrose en necroptosis vergelijken
#MH: structuur, functie, klassen van NOS + regulatie van blood flow in bloedvaten

===13 januari 2016 (vm)===
#JVD: Paper over lipid signal s1p
#JW: Vraag over kleurenblindheid, genetische oorzaak en algemene uitleg
#HM: Vraag over RTK zowel transmembraan als membranaire/cytosolisch uitleggen + sh2 uitleggen

===24 januari 2014 vm===
#paper for Mizuno
#Van den Broek:
##3 ways to study ligand/ GPCR interactions in a cell
## How can you see the difference between agonist, antagonist and reverse agonist
#Winderickx:
## Give the two apoptosis pathways
## Difference between apoptosis, necrosis and necroptosis

===23 januari 2014 vm===
#paper for Mizuno: review Nature 2012 about EGFR (oral examination)
#Vdb: give 3 examples of important lipid compounds of signaling (written)
#Win: explain the genetic mechanisms behind deutan and protan vision defects + explain why so many people suffer from them (written)

===16 jan 2014 nm ===
#Mizuno: Explain the roles of Ca2+ in muscle contraction.
#Winderickx: Give a schematic overview of the biogenesis of small non-coding RNAs. Explain why non-coding RNAs provide an additional layer of gene expression control.
#Vdb: Paper over metabolisme van 20-hydroxyecdyson en Juvenile Hormone III. Make a brief summary and explain orally.

===28 jan 2013 nm ===
#Win: miRNA, RGS, forskolin, ripoptosoom, IAP
#Vdb: Drie componenten bespreken van de insuline groei factor pathway
#De Ley: artikel over histidine fosforylatie

=== 25 jan 2013 ===
#Winderickx: a) Wat zijn miRNA en piRNA? b) Kleurenblinheid is verbonden met verschillende opsines. Verklaar. Geef ook het moleculair genetisch mechanisme van kleurenblindheid.
#Vdb: Artikel [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3128055/ GPCR oligomers in pharmacology and signaling]
#De Ley: Calcium: gradiÃ«nten, golven, oscillaties en intracellular stores. Bespreek ook de moleculaire mechanismen van calcium-signalling.

=== 20 jan 2012 ===
#Winderickx: paper over een yeast proteine met een BH3 domein en daar wat onderzoeken over welke invloed dat proteine had op apoptose. Vraag derbij was: leg het belang uit van het BH3 domein en geef de pathway die hiermee te maken heeft.
#Vdb: Geef 3 (main) receptortypes en leg hun structuur uit en hoe ze werken en een voorbeeld ervan.
#De ley: Een of andere figuur met een hoop proteines en pathways en dan moest ge uitleggen wat elk proteine was. Dingen die er op stond een RTK met JAK en STAT's en dan nog een pathway van PI3K en een pathway van Sos enz... Beetje vanalles bijeen dus!

=== 19 jan 2012 ===
#Vdb: geef 3 voorbeelden van adaptors bij RTK om hun belang aan te tonen
#Mdl: laatste hoofdstuk pg 3 eerste slide : geef alle omicsen , leg dat figuurke uit en geef uitleg over datamining
#JW: paper: Selective expression of human X chromosome-linked green opsin genes / Vragen: Verklaar waarom deuteranopen veel vaker voorkomen dan protanopen. Hoe kan je nagaan of een hybride gen zich vooraan of verderop bevindt in de opsine array? Klopt het dat vrouwen beter zien dan mannen + waarom? Hoe kan je verklaren dat bij een ééneiige tweeling, het ene meisje wel en het andere meisje geen kleurenblindheid vertoont?

=== 31 jan 2011 nm ===

# Van den Broeck: Geef het belang van lipid-derived componenten in cell signal transduction mbv 3 voorbeelden uit verschillende synthetische pathways. En bespreek de functionele eigenschappen van deze componenten.
# Robben: Geef de moleculaire mechanismen en downstream effecten van cytoplasmatische Calcium-release
# Winderickx: artikel [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1409688 Selective expression of human X chromosome-linked green opsin genes ]

===28 jan 2011 nm ===

# Winderickx: Apoptosis is belangrijk bij de ontwikkeling en differentiatie. Leg uit. En geef de intrinsieke en extrinsieke pathway schematisch.
# Robben: Artikel over tyrosine fosfatases.
# Vandenbroeck: Leg uit waarom adaptorproteinen belangrijk zijn bij receptor tyrosine kinases. Geef 3 voorbeelden en bespreek.

=== 20 jan 2011 nm ===

# artikel van Vandenbroeck: insuline en Glut4 transporter
# Robben: functies van ligand afhankelijk calcium kanalen bespreken
# Winderickx: GAP, GEF, GoLoco, RGS en AKAP en hun rol in signaal transductie

=== 20 jan 2011 vm ===

# Vandenbroeck: Artikel over [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16123234 gonadotrope receptors]
# Robben: MAPKs, organisatie, regulatie, upstream en downstream gebeurtenissen
# Winderickx: regulatie van adenylate cyclase

=== 10 sep 2010 ===

# artikel van Winderickx: [http://dx.doi.org/10.1016/j.semcancer.2006.11.006 Yeast apoptosis - From genes to pathways]
# Robben: MAPKs: organisatie, regulatie, upstream en downstream gebeurtenissen
# Vandenbroeck: Bespreek 3 componenten van de geconserveerde insuline/IGF signaaltransductie-pathway (hun moleculaire eigenschappen en daarmee samenhangende functies)

=== 14 jan 2010 ===

# artikel van Vandenbroeck
# robben: NO synthase en functioneren daarvan
# RGS, caspases (intrinsiek en extrinsiek), GoLoco

=== 14 jan 2010 ===

# artikel van robben,
# vandenbroek: experimenten om receptoren te onderzoeken (reporter gene, aequorin, scintillation, ...)
# Jorix: regulatie van cAMP

=== 28 jan 2009 ===
# MDL: Artikel NAADP
# JW: maak vgl tussen apoptose en necrose en geeft schematisch de intrinsieke en extrinsieke pathway weer
# JVdB: Bespreek 3 componenten uit de insuline signalling. (Ik had Insuline, Insuline receptor en IRS-1 en da was in orde)

=== 22 jan 2009 ===

# De Ley: NO en NO synthase(n)
# Winderickx: AKAP, Go Loco, RGS
# VDB: artikel gonadotrope receptor

=== 29 aug 2008 ===

# Vandenbroeck: Artikel: Insulin signalling in growth control in D. Melanogaster (of iets in die aard)
# Winderickx: Bespreek het verschil tussen necrose en apoptose. Bespreek kort de signaalpaden die instaan voor apoptose.
# Deley: Bespreek het verschil tussen Ser/Thr-kinasen en Tyr-kinasen.

=== 24 jan 2008 ===

# MDL: ROS
# JWX: kleurenblindheid, mol. mechanisme
# VDB: artikel p450 and halloween genes en dan nog wat bijvraagskes.

=== 23 jan 2008 ===

# de ley: his fosforylatie
# vandenbroeck: bespreek 3 componenten van insuline pathway
# winderickx: artikel apoptose breng in verband met de cursus

=== 15 jan 2008 ===

# de ley: calcium: gradiënten, golven en osscillaties
# winderinkx: bespreek apoptose versus necrose en geef intrinsic en extrinsic pathway
# vanden broeck: artikel over boss/sevenless pathway in R7 ontwikkeling bij drosophila

=== 15 jan 2008 ===

# De Ley: artikel over phosphohistidines
# Winderickx: Regulatie van G-proteïnes, plus functie van RGS en GoLoco. Geef verschillende klasses G-proteïnen plus hun effector en second messengers.
# Vanden Broeck: Geef 3 functional assays om G-proteïnen te onderzoeken.
# Bijvragen : Leg uit:
#* Sos
#* Prohormoon Convertase
#* Phosphoinositide-3-kinase

Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy

2022-01-28T15:30:23Z

R0837412: /* Exam January 2022 */

[[Categorie: Mabb]]
[[Categorie: Machemie]]

== Vakinformatie ==
Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy
Boeiend vak, gegeven door Johan Hofkens, Maarten Roeffaers, Elke Debroye en Jelle Hendrix.
Vak telt ook soort van (niet verplichte) practicumsessies, waarin je kort ingeleid wordt tot diverse microscopische/fluorescentie-technieken.
Mondeling examen dat open boek is, waarbij je alles (inclusief laptop met internet) mag gebruiken.

ECTS-fiche: https://onderwijsaanbod.kuleuven.be/syllabi/e/G0G59AE.htm

== Examenvragen ==

===Exam 28 January 2022===

Exam was composed of two parts:

First part (Hofkens): Studies have seen that applying a functional substrate makes G-protein couple receptor dimerize and a quicker vesicle formation (recycling of G-protein coupled receptor). With a truncated version of the substrate, you get a slower vesicle formation, and no dimerisation.

Divided in two exercises:
# (5 points) Describe how would you observe that the substrate produces dimerisation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers. (For example: FRET in combination with TIRF).
# (5 points) How would you prove that there is downstream signal transduction, and you want to observe the process of vesicle formation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers.

Second part (Maarten) (6 points): Carbon nanotubes are claimed to be able to enter cancer cells and deliver a drug in cancer tissue. You doubt it, and you want to check if this is true.
What approach would you use? Motivate your answer. Will you be using tags? Justify why you do or do not use and motivate your answer. (For example: Raman microscopy with use of Raman tag Alkyne).

===Mededeling januari 2021===
Door een crash van de wiki zijn verschillende afbeeldingen en bestanden verloren gegaan. Wanneer je op een link klikt en er dus geen bestand opent, is dit spijtig genoeg niet meer beschikbaar op de wiki. Er is dus niks mis met jouw computer of inloggegevens.

Due to a crash of the wiki certain images and documents have been lost. When you try opening them with the link provided, they will not show anymore. There is nothing wrong with your computer or credentials. This is a general problem.
=== 14 januari 2019 NM ===
#Vraag van Hofkens: geef technieken om signaling via EGF-EGFR-Gbr2-Sos-Ras-Raf te bestuderen (vb FRET, STED, FCS) + geef technieken om uit te zoeken of EGFR nog een signaling platform is nadat het in een clathrin-coated vesicle is geïntegreerd (vb FRET). Veel meer uitleg werd gegeven in de opgave.
#Vraag Maarten: Photoactivatible GFP (spectrum gegeven): Kun je dit gebruiken bij:
#*A) Confocal
#*B) PALM
#*C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging. (antwoord: confocal gaat maar niet zo nuttig; ja voor PALM + teken met alle lenzen, dichroic, camera; niet voor STED/RESOLFT want kan je niet terug uitschakelen)

=== 19 januari 2018===
#
#* Er is een excitatie- en emissiespectrum van verschillende FPs gegeven en je hebt een microscoop met lasers 488, 600zoveel en 1050nm. Welke fluorofoor zou je gebruiken om te meten in C. elegans?
#* Je wilt de interactie tussen eiwit A, gelabeld met je antwoord uit 1.1, en eiwit B meten. Hoe zou je dat doen? Welk fluorofoor zou je hiervoor gebruiken?
#* Kun je tegelijkerwijd ook SHG doen? Zo ja, hoe?
#* Teken de opstelling, leg de onderdelen uit en geef specifiek een detail over het objectief.
#
#* Photoactivatible GFP: Kun je dit gebruiken bij A) Confocal B) PALM C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging
#* Bereken een golfgetal om in een golflengte

=== 18 januari 2016 ===
Hetzelfde examen als 17 januari 2014

=== 15 januari 2016===
Vraag 1: Raman:
#bereken de stokes en anti-stokes van de verschillende fluorescent proteins.
#Welk van de volgende fluorescent proteins kan je gebruiken om TEGELIJK fluorescentie en Raman te bekijken. (Raman is net om geen labelling te moeten doen! Je moet dus werken via anti-stokes en dsRED om tegelijk fluorescentie en Raman te kunnen meten)
#Welke detector en filters zou je gebruiken?

[[Media:Fpintrofigure3.jpg]]

Vraag 2:

Verklaar het volgend mechanisme adhv verschillende technieken gezien in de cursus:
Helicase van hepatitis C bestaat uit 3 delen (groen, blauw en geel). Groen en blauw breken de DNA strand 3 nucleotiden, dan is de spanning tussen gele deel en groen+blauw hoog zodat geel verspring tot aan groene en blauwe deel. Dit start opnieuw. De reactie gebruikt hiervoor ATP.

===21 januari 2014===
#Below you can find the spectral properties of photoactivatable-GFP, a green fluorescent protein that has a dark state (purple absorbance) and a fluorescent state (cyan absorbance and green emission).
Is it possible to use this fluorescent protein for in 1) confocal (2p), 2) PALM (2p) or 3) STED microscopy (2p)? If yes, draw and explain the experimental setup (light source, optics and detectors) and highlight the associated strengths and weaknesses of this type of microscopy to study biological specimens.
You have a laser available in the lab that generates photons with an energy of 20494 cm-1, convert this to a wavelength in nanometres. (2p)[[Bestand:PA-GFP.jpg|418px|thumb|center|PA-GFP]]
#Glut4 is one of the sugar transporter proteins in humans and responsible for the tight regulation of blood glucose concentration. The cartoon below represents part of the complex trafficking pathway of GLUT4, namely an overview of the steps involved in GLUT4 trafficking at the plasma membrane. GSV's interact with a host molecules as they are delivered to the cell periphery and thethered, docked and fused at the plasma membrane. GSV's approach the plasma membrane were they are tethered by actin, the exocyst or TBC1D4, or a combination of these in parallel or in series. The vesicle docks with the plasma membrane as the ternary complex is formed between VAMP2 on the GSV and syntaxin4 and SNAP23 on the plasma membrane. This complex can then facilitate fusion of GSV with the plasma membrane. Devise an experiment that would allow to confirm this sequence of events. (8p)
[[Bestand:GLUT4_pathway.jpg|700px|thumb|center|GLUT4]]

=== 17 januari 2014 ===
# In je labo heb je een commerciÃ«le two-photon microscoop met een 1064 nm laser. Je onderzoekt extracellulaire collageenafzettingen in weefsel van muizen, collageen vertoont SHG. Je wil simultaan ook het cytoskelet en een cytoplasmatisch proteÃ¯ne visualiseren, hiervoor heb je de keuze uit enkele FP's, waarvan de absorbtie- en emissiespectra gegeven zijn.
#* Welke FP's wil je gebruiken en waarom?
#* Beschrijf de set-up die je gaat gebruiken (filters, spiegels, objective lens,...) en waarom.
#* Bereken de energie, in golfgetal, van de fotonen die je laser uitzendt.
# Onderzoek ATP synthase (zie Dynamische Biochemie I), een moleculaire motor die, aangedreven door ATP, protonen transporteert over het celmembraan. Het model van het mechanisme is dat de A-en B-subunits rond eiwit D draaien. Door de symetrie worden stappen van 120Â° gesuggereerd. (het gaat dus over: [http://www.youtube.com/watch?v=PjdPTY1wHdQ] )
#* Bedenk een experiment, gebruik makende van de technieken gezien in de cursus, dat deze hypothese kan bevestigen of verwerpen.

=== 21 januari 2013 ===
# Raman Scattering
#* 2 technieken geven voor het waarnemen van metal nanopartikels (DIC en darkfield)
#* SERS ( je moest adenine en thymine onderscheiden en kreeg hiervoor het ramanspectrum)
#**Bereken de signalen die je bij het spectrum van A en T zult krijgen bij een laser van 488 nm
#**Je kreeg een eenvoudige tekening van een microscoop waarop je dan alle golflengtes, filters en detectoren moest plaatsen en benoemen
#** Welke detector gebruik je hierbij?
# Membraanprocessen visualiseren
#*function (was een Ca2+ kanaal, FRET)
#*Colocolization (FCCS)
#*stoichiometrie (NALMS)
#*diffusion (SPT)
# protein folding
#* De bedoeling was een experiment te ontwerpen op basis van deze cursus waarbij men de dynamica van verkeerd gevouwen proteÃ¯ne kon nagaan maar ook van de juist gevouwen
# Laser Safety
#* welke bril moet je nemen uit de tabel
#* bereken hoeveel power het oog dan bereikt (uit de tabel kreeg je de OD van de bril en je kreeg ook de laser specificaties)
#* Hoeveel fotonen bereiken dan het oog?

=== 20 januari 2012 ===
# Raman scattering
#* Drie golfgetallen en de golflengte van de laser gegeven en dan moet je de golflengte bepalen voor de Stokes en anti-Stokes shift
# Single Particle Tracking
#* je moet een traject tekenen voor een nanopartikel opgenomen van 10 verschillende beelden
#* in detail uitleggen hoe je de analyse doet om er een model aan te correleren
#* de camera frame rate bepalen voor als er twee moleculen passeren waarvan Ã©Ã©n traag (1ÂµmÂ²/s) en Ã©Ã©n snel (10ÂµmÂ²/s)
# Sequencing
#* voor- en nadelen van eerste en tweede generatie vs single molecule
#* is het geschikt voor optical mapping?
#* als je een genoom zou kunnen sequeneren op een volledige dag voor 100â‚¬ zou je daar dan gebruik van maken en waarom?
# Bedenk een experiment om de interactie tussen nanopartikels (20-40 nm) en microtubuli (bij celdeling) te visualiseren (aangezien microtubuli rond 15nm zijn, resolutie microscopy: bv. PALM)
# Energietransfer
#* spectra gegeven van 3 verschillende kleurstoffen en daar de energie transfer van bespreken (FRET, energie hopping, andere buiten FÃ¶rster: Dexter (<1nm) en radiatief)

=== 21 januari 2011 ===

# Waarom mogen er niet te veel fotonen waargenomen worden per excitatiepuls bij Time-correlated single photon couting?
#* ANTW: Stel dat er per puls dat door het staal gaan een paar fotonen geÃ«miteerd worden, dan gaat ge telkens maar de eerste waarnemen (tot een stop leiden) en gaat uw uiteindelijke lifetime korter zijn dan werkelijk het geval is...
#
#* Iets met lasser glasses. Je krijgt gegeven dat je een 2P-experiment doet met een Nd:YAG laser en dan is de vraag welke bril je zou kiezen (4 mogelijkheden gegeven) (ANTW: je gaat na bij welke golflengte de laser werkt en je weet dat je met een hoge intensiteit werkt, dus de OD van de bril moet groot zijn en dan moet je ook een bril voor de geschikte golflengte gebruiken)
#* Vervolgens geven ze dat de laser een puls breedte heeft van 7,5ps, een output van 3W en een frequentie van een aantal MHz. De vraag was dan hoeveel fotonen je per puls krijgt) (ANTW: Ephoton=h*c/Î» (Î» weet je omdat je de laser kent) en dan moet ge uw output delen door uw frequentie om te weten welke output 1 puls heeft en die energie deel je dan door Ephoton)
# Ze labelen een spierproteÃ¯ne van C. elegans met mCherry (genetic labeling).
#* De eerste vraag was met welke microscoop detecteer je of het labelen gelukt is? (ANTW: widefield als je gwn wilt weten of het gelukt is, maar confocal om te zien of het wel in spieren zit)
#* Bedenk een techniek waarbij je geen labels gebruikt (ANTW: 2nd Harmonic generation)
#* Stel een schema op van de set-up waarbij je A en B combineert, zodat je beide simultaan kan meten (ANTW: hier willen ze zien of ge snapt hoe dichroÃ¯c mirror werkt enzo, da ge rekening houdt met de golflengtes en doorlaten en weerkaatsen enzo..)
#* Vervolgens geven ze dat je met raman een proteÃ¯ne waarneemt met een specifiek signaal op 1600cm-1. En ze willen nu weten waar ze het signaal van de laserbeam waarnemen bij SRS als je weet dat de stokes beam op 1064nm is. En geef dan ook waar je het CARS signaal zou waarnemen (ANTW: die 1600 is eigenlijk Î©vibr, en nu weet ge da Ï‰pump= Ï‰stokes+ Î©vibr, hoe dit met die frequenties dan exact in elkaar steekt weet ik nimeer, wnt ik had deze vraag ni juist en ze hebbe da dan zo snel proberen uit te leggenâ€¦ eens ge dan Ï‰pump weet, kunt ge het signaal voor CARS bepalen met 2Ï‰pump-Ï‰stokes)
#* Voordelen van CARS tov spontane Raman (ANTW: vrij letterlijk in cursus :p)
#* Teken weer een schema maar nu met het extra ding van raman
# Is een high NA nodig voor FCS? (ANTW: ja, omdat ge hierdoor beter kunt focussen in 1 vlak, het draagt bij tot een kleiner confocul volume, want minder grote hoogte (Z-as), of toch iets in die aardâ€¦)
# Bespreek met welke technieken je dynamica kan bestuderen en wat is het verschil tussen die technieken (ANTW: FCS, SPT en FRAP kort uitleggen, en het verschil is da ge bij FCS en FRAP een gemiddelde life-time gaat berekenen en bij SPT. Bij FCS kunt ge tov FRAP wel eventueel een onderscheid maken tussen populaties, dit is bij FRAP helemaal niet mogelijk)
#
#* Ge kreeg een figuurtje van een holiday junctie met fluoroforen en er was een evenwicht tussen 2 conformationele toestanden. Dan kwam ge te weten dat CY5 een acceptor is van CY3 en dat CY5.5 en acceptor is van CY5. Er gaat FRET optreden tussen deze fluoroforen en ge moest een schema geven van de Intensiteit tov de tijd met het gegeven da ge eerst 20s conformatie 1 had en dan 20s conformatie 2 om trg 20s conformatie 1 te hebben en dan treed er bleaching op van CY5.5 en na nog eens 10s treed er bleaching op van CY3, maar het moeilijke eraan was dat ge het volgende kreeg: de lifetime van CY3 is 5ns, die van CY5 is 4ns en die van CY5.5 is 7. In conformatie 1 zijn de lifetimes de volgende CY3:1ns, CY5 2ns en C5.5:7ns, in conformatie 2 verandert dan enkel de lifetime van CY3 en deze wordt 3ns. (ANTW: de bedoeling is da ge hier efficienties uitrekent (E=1-(Ï„DA/Ï„D) en zo dus relatieve intensiteiten gaat uitzetten, achteraf gezien wel een simpele oplossing, maar er zijn er maar weinig die dit haddenâ€¦)
#* Krijgt ge hetzelfe resultaat als je CY5 en CY5.5 vervangt door 2 DRONPAs? En krijg je hetzelfde resultaat als je beide vervangt door 2KAEDEs? (ANTW: Doordat je vervangt door 2 keer hetzelfde ga je uiteraard niet hetzelfde zien. DRONPA is photoswitchable en zo kan je FRET combineren met aan en uit zetten van DRONPA, KAEDE is photoconverteble en zo kan je FRET combineren met switchen tss 2 kleuren van KAEDE)
# Hoeveel labels moet een 2Âµm actinefilament bevatten opdat ge het met 10nm zou kunnen waarnemen? (ANTW: 2000nm/10nm=200 ïƒ je hebt minstens het dubbel hiervan nodig (400), wnt je wilt weten wat er zich tussen labels dat op 10nm van elkaar staan afspeelt, dus minstens om de 5nm een label zetten)

=== 1 september 2010 ===

[[Bestand:HIV_replication_cycle.gif|150px|thumb|right|HIV replication cycle]]
# (12 punten) Afbeelding HIV replicatieyclus gegeven. Bedenk experimenten gebaseerd op technieken die we in de cursus gezien hebben (en uiteindelijk ook biochemische technieken) om onderstaande onderzoeksvragen te behandelen. Hoe kan je:
#* docking van het virus visualiseren?
#* bewijzen dat docking al dan niet receptor-gemedieerd is?
#* aantonen of transport van het viraal DNA gebeurt door actief transport of door vrije diffusie?
#* bewijzen dat het viraal DNA door nucleaire poriÃ«n wordt getransporteerd?
#* bewijzen dat het viraal DNA geÃ¯ntegreerd is in het cellulaire DNA?
#* bewijzen dat er nieuwe virale eiwitten worden aangemaakt?
# (4 punten) Is de volgende bewering correct of niet?: "Voor het bestuderen van moleculaire interacties is FCS een betere techniek dan BiFC." Motiveer je antwoord.
# (4 punten) Hoe kan men het contrast in lichtmicroscopie verbeteren?

=== 18 januari 2010 ===

# Hoe kan je DNA sequencen met behulp van raman spectroscopie? Stel een experimentele setup voor.
# Waar moet je op letten bij fluorescentie in vivo? Wat zijn de problemen, hoe kan je die oplossen? Welke technieken zijn geschikt en wat zijn voordelen/nadelen?
# Geef manieren om contrast in optische microscopie te verhogen.
# Signaalpathway gegeven van een G-proteine en adenyl cyclase (in membraan). Hoe kan je de interactie tussen G-proteine en adenyl cyclase onderzoeken? Is dit systeem geschikt voor single molecule? Geef de single molecule time traces.
# Verschil tussen anti-stokes raman (direct meten) en CARS.
# Ontwerp een experiment om de toxiciteit van nanoparticles te onderzoeken. Vaak wordt gesuggereerd dat nanoparticles direct interfereren met de celcyclus. Hoe kan je dat onderzoeken?
# Vraagje over FRAP van membraanproteine. Berekenen van diffusiecoÃ«fficient. (500 nm diameter bleach spot + half recovery op x s gegeven).

=== 15 januari 2010 ===

# Voordelen van single molecule DNA sequencing? Verschil tussen methode met exonuclease en met polymerase? Methode voor single molecule DNA sequencing zonder fluorescentie? (4 ptn)
# Bestuderen van protein folding. Vaststellen van 'rare misfolding' en 'folding'? Kinetica van folding en misfolding? Probability van misfolding? Stel een experiment op met de geziene technieken.) (4 ptn)
# Is het mogelijk om de temperatuur te bepalen met Raman Spectroscopy? (2 ptn)
# Conformatieveranderingen van <1nm bestuderen (3 ptn)
# Technieken om single molecules te bestuderen zonder fluo (2 ptn)
# Bestuderen van de dynamica van actinefilamenten (3 ptn)
# Foto's van fluo-gekleurde cellen: multi-exposure view, intensiteit, lifetime image: wordt elk fluorofoor correct geÃ¯dentificeerd in legende? Hoe werd lifetime image gemaakt? (2 ptn)

=== 30 januari 2009 ===

# Gegeven een figuur van DNA-sequentie-methode. Een proefopstelling daarvoor tekenen, en karakteristieken van de dyes en de optische componenten geven.
# Wat is de PSF. Kan je die veranderen? Hoe?
# Vreemde vraag van halve bladzijde. Kwam er op neer dat ze het zelf nog niet zo goed wisten en dat een E. coli ongeveer de grootte van de focal spot heeft.
# Drie vraagjes van Visser. Bijna letterlijk.
# Nog drie vraagjes van Visser. Al bijna even letterlijk.
# Een polynucleotide (<20nt) is aan de ene kant gemerkt met een dye (MB121 of zo). Er zijn een paar mutaties gemaakt: er werd op bepaalde plaatsen G (dat in de "wt" afwezig was) ingebracht. Resultaat: lifetime vermindert, abs/em niet (rond de 600nm, G zit rond 300nm is gegeven). Wat gebeurt er en hoe kan je het kwantitatief bestuderen?

=== 26 januari 2009 ===

# Welke methode zou je gebruiken om chaperone gemedieerd folding proces te onderzoeken, bespreek kort de theoratische achtergrond. (FRET) Stel 2 mogelijke labelingsstrategieen voor. Kan dit ook bestudeerd worden via elektron transfer, hoe ziet een single molecule trace er dan uit en dergelijke.
# Hoe zou je de volgende processen bestuderen: Ca2+ release in cellen, diffusie in membraan, colocalisatie, stoichiometrie.
# Bespreek de uitspraak 'PALM en STED zijn volledig gebaseerd op hetzelfde principe'
# Hoe kan je achtergrond/autofluorescentie vermijden of bestrijden? Hoe verhoog je contrast in optische microscopie (wees volledig)
# Twee kleinere vraagjes over FRET-FRAP experiment met de androgen receptor
# Drie kleinere vraagjes rond FLIM

=== 18 januari 2008 ===

# (4punten) De eerste vraag ging over een RET waarbij drie fluorophoren in twee conformaties voorkomen en naargelang de conformatie was er tussen twee van de drie RET en dan moest je daar een diagram van tekenen: Fluorescentie intensiteit ifv de tijd. Als extra moest je dan ook nog eens een diagram tekenen als er RET was tussen alle drie. Bij deze vraag moest je telkens rekening houden met de efficientie van transfer.
# (3punten) Een schema dat je moest vervolledigen: je kreeg de technieken FCS, FRAP, FCCS en FRET-FLIM en dan moest je bij alle zeggen of je er dynamics mee kon bestuderen, of je naar moleculaire interacties kon kijken, de conc. range die nodig is voor de techniek en de tijdsschaal waarop gekeken wordt.
# (2punten) Als je met een microscoop met twee kanalen co-localizatie waarneemt, heb je dan interactie tussen beide moleculen?
# (2punten) We hadden in de les twee artikels behandeld van Sunexie (of zoiets)
#* Waarom wordt het proteine onder de lac promotor tot expressie gebracht?
#* Waarom veranker je YFP aan een membraanproteine?
# (3punten) Wat is de Point spread function (PSF) in microscopie. Kun je deze veranderen en zoja, hoe?
# (4punten) Hoe kun je autofluorescentie vermijden/overkomen vanuit het oogpunt van microscopie?
# (2punten) Je hebt een bepaalde dye die aan het 3' uiteinde van een oligonucleotide wordt gehangen. (dan had je een tabelletje met 4 oligonucleotiden en dan de levensduur van de dye) Als er zich een Guanine in de buurt van de dye komt, dan wordt de levensduur van de dye plots veel korter. Het absorptiemaximum van de dye ligt rond 650nm en het absorptieminimum rond 680. Nucleotiden absorberen enkel op golflengtes kleiner dan 330nm.
#* Van welk proces is hier sprake?
#* Welke quantitatieve informatie kun je hieruit afleiden?</text>

Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy

2022-01-28T15:29:58Z

R0837412: /* Exam January 2022 */

[[Categorie: Mabb]]
[[Categorie: Machemie]]

== Vakinformatie ==
Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy
Boeiend vak, gegeven door Johan Hofkens, Maarten Roeffaers, Elke Debroye en Jelle Hendrix.
Vak telt ook soort van (niet verplichte) practicumsessies, waarin je kort ingeleid wordt tot diverse microscopische/fluorescentie-technieken.
Mondeling examen dat open boek is, waarbij je alles (inclusief laptop met internet) mag gebruiken.

ECTS-fiche: https://onderwijsaanbod.kuleuven.be/syllabi/e/G0G59AE.htm

== Examenvragen ==

===Exam January 2022===

Exam was composed of two parts:

First part (Hofkens): Studies have seen that applying a functional substrate makes G-protein couple receptor dimerize and a quicker vesicle formation (recycling of G-protein coupled receptor). With a truncated version of the substrate, you get a slower vesicle formation, and no dimerisation.

Divided in two exercises:
# (5 points) Describe how would you observe that the substrate produces dimerisation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers. (For example: FRET in combination with TIRF).
# (5 points) How would you prove that there is downstream signal transduction, and you want to observe the process of vesicle formation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers.

Second part (Maarten) (6 points): Carbon nanotubes are claimed to be able to enter cancer cells and deliver a drug in cancer tissue. You doubt it, and you want to check if this is true.
What approach would you use? Motivate your answer. Will you be using tags? Justify why you do or do not use and motivate your answer. (For example: Raman microscopy with use of Raman tag Alkyne).

===Mededeling januari 2021===
Door een crash van de wiki zijn verschillende afbeeldingen en bestanden verloren gegaan. Wanneer je op een link klikt en er dus geen bestand opent, is dit spijtig genoeg niet meer beschikbaar op de wiki. Er is dus niks mis met jouw computer of inloggegevens.

Due to a crash of the wiki certain images and documents have been lost. When you try opening them with the link provided, they will not show anymore. There is nothing wrong with your computer or credentials. This is a general problem.
=== 14 januari 2019 NM ===
#Vraag van Hofkens: geef technieken om signaling via EGF-EGFR-Gbr2-Sos-Ras-Raf te bestuderen (vb FRET, STED, FCS) + geef technieken om uit te zoeken of EGFR nog een signaling platform is nadat het in een clathrin-coated vesicle is geïntegreerd (vb FRET). Veel meer uitleg werd gegeven in de opgave.
#Vraag Maarten: Photoactivatible GFP (spectrum gegeven): Kun je dit gebruiken bij:
#*A) Confocal
#*B) PALM
#*C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging. (antwoord: confocal gaat maar niet zo nuttig; ja voor PALM + teken met alle lenzen, dichroic, camera; niet voor STED/RESOLFT want kan je niet terug uitschakelen)

=== 19 januari 2018===
#
#* Er is een excitatie- en emissiespectrum van verschillende FPs gegeven en je hebt een microscoop met lasers 488, 600zoveel en 1050nm. Welke fluorofoor zou je gebruiken om te meten in C. elegans?
#* Je wilt de interactie tussen eiwit A, gelabeld met je antwoord uit 1.1, en eiwit B meten. Hoe zou je dat doen? Welk fluorofoor zou je hiervoor gebruiken?
#* Kun je tegelijkerwijd ook SHG doen? Zo ja, hoe?
#* Teken de opstelling, leg de onderdelen uit en geef specifiek een detail over het objectief.
#
#* Photoactivatible GFP: Kun je dit gebruiken bij A) Confocal B) PALM C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging
#* Bereken een golfgetal om in een golflengte

=== 18 januari 2016 ===
Hetzelfde examen als 17 januari 2014

=== 15 januari 2016===
Vraag 1: Raman:
#bereken de stokes en anti-stokes van de verschillende fluorescent proteins.
#Welk van de volgende fluorescent proteins kan je gebruiken om TEGELIJK fluorescentie en Raman te bekijken. (Raman is net om geen labelling te moeten doen! Je moet dus werken via anti-stokes en dsRED om tegelijk fluorescentie en Raman te kunnen meten)
#Welke detector en filters zou je gebruiken?

[[Media:Fpintrofigure3.jpg]]

Vraag 2:

Verklaar het volgend mechanisme adhv verschillende technieken gezien in de cursus:
Helicase van hepatitis C bestaat uit 3 delen (groen, blauw en geel). Groen en blauw breken de DNA strand 3 nucleotiden, dan is de spanning tussen gele deel en groen+blauw hoog zodat geel verspring tot aan groene en blauwe deel. Dit start opnieuw. De reactie gebruikt hiervoor ATP.

===21 januari 2014===
#Below you can find the spectral properties of photoactivatable-GFP, a green fluorescent protein that has a dark state (purple absorbance) and a fluorescent state (cyan absorbance and green emission).
Is it possible to use this fluorescent protein for in 1) confocal (2p), 2) PALM (2p) or 3) STED microscopy (2p)? If yes, draw and explain the experimental setup (light source, optics and detectors) and highlight the associated strengths and weaknesses of this type of microscopy to study biological specimens.
You have a laser available in the lab that generates photons with an energy of 20494 cm-1, convert this to a wavelength in nanometres. (2p)[[Bestand:PA-GFP.jpg|418px|thumb|center|PA-GFP]]
#Glut4 is one of the sugar transporter proteins in humans and responsible for the tight regulation of blood glucose concentration. The cartoon below represents part of the complex trafficking pathway of GLUT4, namely an overview of the steps involved in GLUT4 trafficking at the plasma membrane. GSV's interact with a host molecules as they are delivered to the cell periphery and thethered, docked and fused at the plasma membrane. GSV's approach the plasma membrane were they are tethered by actin, the exocyst or TBC1D4, or a combination of these in parallel or in series. The vesicle docks with the plasma membrane as the ternary complex is formed between VAMP2 on the GSV and syntaxin4 and SNAP23 on the plasma membrane. This complex can then facilitate fusion of GSV with the plasma membrane. Devise an experiment that would allow to confirm this sequence of events. (8p)
[[Bestand:GLUT4_pathway.jpg|700px|thumb|center|GLUT4]]

=== 17 januari 2014 ===
# In je labo heb je een commerciÃ«le two-photon microscoop met een 1064 nm laser. Je onderzoekt extracellulaire collageenafzettingen in weefsel van muizen, collageen vertoont SHG. Je wil simultaan ook het cytoskelet en een cytoplasmatisch proteÃ¯ne visualiseren, hiervoor heb je de keuze uit enkele FP's, waarvan de absorbtie- en emissiespectra gegeven zijn.
#* Welke FP's wil je gebruiken en waarom?
#* Beschrijf de set-up die je gaat gebruiken (filters, spiegels, objective lens,...) en waarom.
#* Bereken de energie, in golfgetal, van de fotonen die je laser uitzendt.
# Onderzoek ATP synthase (zie Dynamische Biochemie I), een moleculaire motor die, aangedreven door ATP, protonen transporteert over het celmembraan. Het model van het mechanisme is dat de A-en B-subunits rond eiwit D draaien. Door de symetrie worden stappen van 120Â° gesuggereerd. (het gaat dus over: [http://www.youtube.com/watch?v=PjdPTY1wHdQ] )
#* Bedenk een experiment, gebruik makende van de technieken gezien in de cursus, dat deze hypothese kan bevestigen of verwerpen.

=== 21 januari 2013 ===
# Raman Scattering
#* 2 technieken geven voor het waarnemen van metal nanopartikels (DIC en darkfield)
#* SERS ( je moest adenine en thymine onderscheiden en kreeg hiervoor het ramanspectrum)
#**Bereken de signalen die je bij het spectrum van A en T zult krijgen bij een laser van 488 nm
#**Je kreeg een eenvoudige tekening van een microscoop waarop je dan alle golflengtes, filters en detectoren moest plaatsen en benoemen
#** Welke detector gebruik je hierbij?
# Membraanprocessen visualiseren
#*function (was een Ca2+ kanaal, FRET)
#*Colocolization (FCCS)
#*stoichiometrie (NALMS)
#*diffusion (SPT)
# protein folding
#* De bedoeling was een experiment te ontwerpen op basis van deze cursus waarbij men de dynamica van verkeerd gevouwen proteÃ¯ne kon nagaan maar ook van de juist gevouwen
# Laser Safety
#* welke bril moet je nemen uit de tabel
#* bereken hoeveel power het oog dan bereikt (uit de tabel kreeg je de OD van de bril en je kreeg ook de laser specificaties)
#* Hoeveel fotonen bereiken dan het oog?

=== 20 januari 2012 ===
# Raman scattering
#* Drie golfgetallen en de golflengte van de laser gegeven en dan moet je de golflengte bepalen voor de Stokes en anti-Stokes shift
# Single Particle Tracking
#* je moet een traject tekenen voor een nanopartikel opgenomen van 10 verschillende beelden
#* in detail uitleggen hoe je de analyse doet om er een model aan te correleren
#* de camera frame rate bepalen voor als er twee moleculen passeren waarvan Ã©Ã©n traag (1ÂµmÂ²/s) en Ã©Ã©n snel (10ÂµmÂ²/s)
# Sequencing
#* voor- en nadelen van eerste en tweede generatie vs single molecule
#* is het geschikt voor optical mapping?
#* als je een genoom zou kunnen sequeneren op een volledige dag voor 100â‚¬ zou je daar dan gebruik van maken en waarom?
# Bedenk een experiment om de interactie tussen nanopartikels (20-40 nm) en microtubuli (bij celdeling) te visualiseren (aangezien microtubuli rond 15nm zijn, resolutie microscopy: bv. PALM)
# Energietransfer
#* spectra gegeven van 3 verschillende kleurstoffen en daar de energie transfer van bespreken (FRET, energie hopping, andere buiten FÃ¶rster: Dexter (<1nm) en radiatief)

=== 21 januari 2011 ===

# Waarom mogen er niet te veel fotonen waargenomen worden per excitatiepuls bij Time-correlated single photon couting?
#* ANTW: Stel dat er per puls dat door het staal gaan een paar fotonen geÃ«miteerd worden, dan gaat ge telkens maar de eerste waarnemen (tot een stop leiden) en gaat uw uiteindelijke lifetime korter zijn dan werkelijk het geval is...
#
#* Iets met lasser glasses. Je krijgt gegeven dat je een 2P-experiment doet met een Nd:YAG laser en dan is de vraag welke bril je zou kiezen (4 mogelijkheden gegeven) (ANTW: je gaat na bij welke golflengte de laser werkt en je weet dat je met een hoge intensiteit werkt, dus de OD van de bril moet groot zijn en dan moet je ook een bril voor de geschikte golflengte gebruiken)
#* Vervolgens geven ze dat de laser een puls breedte heeft van 7,5ps, een output van 3W en een frequentie van een aantal MHz. De vraag was dan hoeveel fotonen je per puls krijgt) (ANTW: Ephoton=h*c/Î» (Î» weet je omdat je de laser kent) en dan moet ge uw output delen door uw frequentie om te weten welke output 1 puls heeft en die energie deel je dan door Ephoton)
# Ze labelen een spierproteÃ¯ne van C. elegans met mCherry (genetic labeling).
#* De eerste vraag was met welke microscoop detecteer je of het labelen gelukt is? (ANTW: widefield als je gwn wilt weten of het gelukt is, maar confocal om te zien of het wel in spieren zit)
#* Bedenk een techniek waarbij je geen labels gebruikt (ANTW: 2nd Harmonic generation)
#* Stel een schema op van de set-up waarbij je A en B combineert, zodat je beide simultaan kan meten (ANTW: hier willen ze zien of ge snapt hoe dichroÃ¯c mirror werkt enzo, da ge rekening houdt met de golflengtes en doorlaten en weerkaatsen enzo..)
#* Vervolgens geven ze dat je met raman een proteÃ¯ne waarneemt met een specifiek signaal op 1600cm-1. En ze willen nu weten waar ze het signaal van de laserbeam waarnemen bij SRS als je weet dat de stokes beam op 1064nm is. En geef dan ook waar je het CARS signaal zou waarnemen (ANTW: die 1600 is eigenlijk Î©vibr, en nu weet ge da Ï‰pump= Ï‰stokes+ Î©vibr, hoe dit met die frequenties dan exact in elkaar steekt weet ik nimeer, wnt ik had deze vraag ni juist en ze hebbe da dan zo snel proberen uit te leggenâ€¦ eens ge dan Ï‰pump weet, kunt ge het signaal voor CARS bepalen met 2Ï‰pump-Ï‰stokes)
#* Voordelen van CARS tov spontane Raman (ANTW: vrij letterlijk in cursus :p)
#* Teken weer een schema maar nu met het extra ding van raman
# Is een high NA nodig voor FCS? (ANTW: ja, omdat ge hierdoor beter kunt focussen in 1 vlak, het draagt bij tot een kleiner confocul volume, want minder grote hoogte (Z-as), of toch iets in die aardâ€¦)
# Bespreek met welke technieken je dynamica kan bestuderen en wat is het verschil tussen die technieken (ANTW: FCS, SPT en FRAP kort uitleggen, en het verschil is da ge bij FCS en FRAP een gemiddelde life-time gaat berekenen en bij SPT. Bij FCS kunt ge tov FRAP wel eventueel een onderscheid maken tussen populaties, dit is bij FRAP helemaal niet mogelijk)
#
#* Ge kreeg een figuurtje van een holiday junctie met fluoroforen en er was een evenwicht tussen 2 conformationele toestanden. Dan kwam ge te weten dat CY5 een acceptor is van CY3 en dat CY5.5 en acceptor is van CY5. Er gaat FRET optreden tussen deze fluoroforen en ge moest een schema geven van de Intensiteit tov de tijd met het gegeven da ge eerst 20s conformatie 1 had en dan 20s conformatie 2 om trg 20s conformatie 1 te hebben en dan treed er bleaching op van CY5.5 en na nog eens 10s treed er bleaching op van CY3, maar het moeilijke eraan was dat ge het volgende kreeg: de lifetime van CY3 is 5ns, die van CY5 is 4ns en die van CY5.5 is 7. In conformatie 1 zijn de lifetimes de volgende CY3:1ns, CY5 2ns en C5.5:7ns, in conformatie 2 verandert dan enkel de lifetime van CY3 en deze wordt 3ns. (ANTW: de bedoeling is da ge hier efficienties uitrekent (E=1-(Ï„DA/Ï„D) en zo dus relatieve intensiteiten gaat uitzetten, achteraf gezien wel een simpele oplossing, maar er zijn er maar weinig die dit haddenâ€¦)
#* Krijgt ge hetzelfe resultaat als je CY5 en CY5.5 vervangt door 2 DRONPAs? En krijg je hetzelfde resultaat als je beide vervangt door 2KAEDEs? (ANTW: Doordat je vervangt door 2 keer hetzelfde ga je uiteraard niet hetzelfde zien. DRONPA is photoswitchable en zo kan je FRET combineren met aan en uit zetten van DRONPA, KAEDE is photoconverteble en zo kan je FRET combineren met switchen tss 2 kleuren van KAEDE)
# Hoeveel labels moet een 2Âµm actinefilament bevatten opdat ge het met 10nm zou kunnen waarnemen? (ANTW: 2000nm/10nm=200 ïƒ je hebt minstens het dubbel hiervan nodig (400), wnt je wilt weten wat er zich tussen labels dat op 10nm van elkaar staan afspeelt, dus minstens om de 5nm een label zetten)

=== 1 september 2010 ===

[[Bestand:HIV_replication_cycle.gif|150px|thumb|right|HIV replication cycle]]
# (12 punten) Afbeelding HIV replicatieyclus gegeven. Bedenk experimenten gebaseerd op technieken die we in de cursus gezien hebben (en uiteindelijk ook biochemische technieken) om onderstaande onderzoeksvragen te behandelen. Hoe kan je:
#* docking van het virus visualiseren?
#* bewijzen dat docking al dan niet receptor-gemedieerd is?
#* aantonen of transport van het viraal DNA gebeurt door actief transport of door vrije diffusie?
#* bewijzen dat het viraal DNA door nucleaire poriÃ«n wordt getransporteerd?
#* bewijzen dat het viraal DNA geÃ¯ntegreerd is in het cellulaire DNA?
#* bewijzen dat er nieuwe virale eiwitten worden aangemaakt?
# (4 punten) Is de volgende bewering correct of niet?: "Voor het bestuderen van moleculaire interacties is FCS een betere techniek dan BiFC." Motiveer je antwoord.
# (4 punten) Hoe kan men het contrast in lichtmicroscopie verbeteren?

=== 18 januari 2010 ===

# Hoe kan je DNA sequencen met behulp van raman spectroscopie? Stel een experimentele setup voor.
# Waar moet je op letten bij fluorescentie in vivo? Wat zijn de problemen, hoe kan je die oplossen? Welke technieken zijn geschikt en wat zijn voordelen/nadelen?
# Geef manieren om contrast in optische microscopie te verhogen.
# Signaalpathway gegeven van een G-proteine en adenyl cyclase (in membraan). Hoe kan je de interactie tussen G-proteine en adenyl cyclase onderzoeken? Is dit systeem geschikt voor single molecule? Geef de single molecule time traces.
# Verschil tussen anti-stokes raman (direct meten) en CARS.
# Ontwerp een experiment om de toxiciteit van nanoparticles te onderzoeken. Vaak wordt gesuggereerd dat nanoparticles direct interfereren met de celcyclus. Hoe kan je dat onderzoeken?
# Vraagje over FRAP van membraanproteine. Berekenen van diffusiecoÃ«fficient. (500 nm diameter bleach spot + half recovery op x s gegeven).

=== 15 januari 2010 ===

# Voordelen van single molecule DNA sequencing? Verschil tussen methode met exonuclease en met polymerase? Methode voor single molecule DNA sequencing zonder fluorescentie? (4 ptn)
# Bestuderen van protein folding. Vaststellen van 'rare misfolding' en 'folding'? Kinetica van folding en misfolding? Probability van misfolding? Stel een experiment op met de geziene technieken.) (4 ptn)
# Is het mogelijk om de temperatuur te bepalen met Raman Spectroscopy? (2 ptn)
# Conformatieveranderingen van <1nm bestuderen (3 ptn)
# Technieken om single molecules te bestuderen zonder fluo (2 ptn)
# Bestuderen van de dynamica van actinefilamenten (3 ptn)
# Foto's van fluo-gekleurde cellen: multi-exposure view, intensiteit, lifetime image: wordt elk fluorofoor correct geÃ¯dentificeerd in legende? Hoe werd lifetime image gemaakt? (2 ptn)

=== 30 januari 2009 ===

# Gegeven een figuur van DNA-sequentie-methode. Een proefopstelling daarvoor tekenen, en karakteristieken van de dyes en de optische componenten geven.
# Wat is de PSF. Kan je die veranderen? Hoe?
# Vreemde vraag van halve bladzijde. Kwam er op neer dat ze het zelf nog niet zo goed wisten en dat een E. coli ongeveer de grootte van de focal spot heeft.
# Drie vraagjes van Visser. Bijna letterlijk.
# Nog drie vraagjes van Visser. Al bijna even letterlijk.
# Een polynucleotide (<20nt) is aan de ene kant gemerkt met een dye (MB121 of zo). Er zijn een paar mutaties gemaakt: er werd op bepaalde plaatsen G (dat in de "wt" afwezig was) ingebracht. Resultaat: lifetime vermindert, abs/em niet (rond de 600nm, G zit rond 300nm is gegeven). Wat gebeurt er en hoe kan je het kwantitatief bestuderen?

=== 26 januari 2009 ===

# Welke methode zou je gebruiken om chaperone gemedieerd folding proces te onderzoeken, bespreek kort de theoratische achtergrond. (FRET) Stel 2 mogelijke labelingsstrategieen voor. Kan dit ook bestudeerd worden via elektron transfer, hoe ziet een single molecule trace er dan uit en dergelijke.
# Hoe zou je de volgende processen bestuderen: Ca2+ release in cellen, diffusie in membraan, colocalisatie, stoichiometrie.
# Bespreek de uitspraak 'PALM en STED zijn volledig gebaseerd op hetzelfde principe'
# Hoe kan je achtergrond/autofluorescentie vermijden of bestrijden? Hoe verhoog je contrast in optische microscopie (wees volledig)
# Twee kleinere vraagjes over FRET-FRAP experiment met de androgen receptor
# Drie kleinere vraagjes rond FLIM

=== 18 januari 2008 ===

# (4punten) De eerste vraag ging over een RET waarbij drie fluorophoren in twee conformaties voorkomen en naargelang de conformatie was er tussen twee van de drie RET en dan moest je daar een diagram van tekenen: Fluorescentie intensiteit ifv de tijd. Als extra moest je dan ook nog eens een diagram tekenen als er RET was tussen alle drie. Bij deze vraag moest je telkens rekening houden met de efficientie van transfer.
# (3punten) Een schema dat je moest vervolledigen: je kreeg de technieken FCS, FRAP, FCCS en FRET-FLIM en dan moest je bij alle zeggen of je er dynamics mee kon bestuderen, of je naar moleculaire interacties kon kijken, de conc. range die nodig is voor de techniek en de tijdsschaal waarop gekeken wordt.
# (2punten) Als je met een microscoop met twee kanalen co-localizatie waarneemt, heb je dan interactie tussen beide moleculen?
# (2punten) We hadden in de les twee artikels behandeld van Sunexie (of zoiets)
#* Waarom wordt het proteine onder de lac promotor tot expressie gebracht?
#* Waarom veranker je YFP aan een membraanproteine?
# (3punten) Wat is de Point spread function (PSF) in microscopie. Kun je deze veranderen en zoja, hoe?
# (4punten) Hoe kun je autofluorescentie vermijden/overkomen vanuit het oogpunt van microscopie?
# (2punten) Je hebt een bepaalde dye die aan het 3' uiteinde van een oligonucleotide wordt gehangen. (dan had je een tabelletje met 4 oligonucleotiden en dan de levensduur van de dye) Als er zich een Guanine in de buurt van de dye komt, dan wordt de levensduur van de dye plots veel korter. Het absorptiemaximum van de dye ligt rond 650nm en het absorptieminimum rond 680. Nucleotiden absorberen enkel op golflengtes kleiner dan 330nm.
#* Van welk proces is hier sprake?
#* Welke quantitatieve informatie kun je hieruit afleiden?</text>

Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy

2022-01-28T15:29:00Z

R0837412: /* Exam January 2022 */

[[Categorie: Mabb]]
[[Categorie: Machemie]]

== Vakinformatie ==
Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy
Boeiend vak, gegeven door Johan Hofkens, Maarten Roeffaers, Elke Debroye en Jelle Hendrix.
Vak telt ook soort van (niet verplichte) practicumsessies, waarin je kort ingeleid wordt tot diverse microscopische/fluorescentie-technieken.
Mondeling examen dat open boek is, waarbij je alles (inclusief laptop met internet) mag gebruiken.

ECTS-fiche: https://onderwijsaanbod.kuleuven.be/syllabi/e/G0G59AE.htm

== Examenvragen ==

===Exam January 2022===
Exam was composed of two parts:
First part (Hofkens): Studies have seen that applying a functional substrate makes G-protein couple receptor dimerize and a quicker vesicle formation (recycling of G-protein coupled receptor). With a truncated version of the substrate, you get a slower vesicle formation, and no dimerisation.

Divided in two exercises:
# (5 points) Describe how would you observe that the substrate produces dimerisation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers. (For example: FRET in combination with TIRF).
# (5 points) How would you prove that there is downstream signal transduction, and you want to observe the process of vesicle formation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers.

Second part (Maarten) (6 points): Carbon nanotubes are claimed to be able to enter cancer cells and deliver a drug in cancer tissue. You doubt it, and you want to check if this is true.
What approach would you use? Motivate your answer. Will you be using tags? Justify why you do or do not use and motivate your answer. (For example: Raman microscopy with use of Raman tag Alkyne).

===Mededeling januari 2021===
Door een crash van de wiki zijn verschillende afbeeldingen en bestanden verloren gegaan. Wanneer je op een link klikt en er dus geen bestand opent, is dit spijtig genoeg niet meer beschikbaar op de wiki. Er is dus niks mis met jouw computer of inloggegevens.

Due to a crash of the wiki certain images and documents have been lost. When you try opening them with the link provided, they will not show anymore. There is nothing wrong with your computer or credentials. This is a general problem.
=== 14 januari 2019 NM ===
#Vraag van Hofkens: geef technieken om signaling via EGF-EGFR-Gbr2-Sos-Ras-Raf te bestuderen (vb FRET, STED, FCS) + geef technieken om uit te zoeken of EGFR nog een signaling platform is nadat het in een clathrin-coated vesicle is geïntegreerd (vb FRET). Veel meer uitleg werd gegeven in de opgave.
#Vraag Maarten: Photoactivatible GFP (spectrum gegeven): Kun je dit gebruiken bij:
#*A) Confocal
#*B) PALM
#*C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging. (antwoord: confocal gaat maar niet zo nuttig; ja voor PALM + teken met alle lenzen, dichroic, camera; niet voor STED/RESOLFT want kan je niet terug uitschakelen)

=== 19 januari 2018===
#
#* Er is een excitatie- en emissiespectrum van verschillende FPs gegeven en je hebt een microscoop met lasers 488, 600zoveel en 1050nm. Welke fluorofoor zou je gebruiken om te meten in C. elegans?
#* Je wilt de interactie tussen eiwit A, gelabeld met je antwoord uit 1.1, en eiwit B meten. Hoe zou je dat doen? Welk fluorofoor zou je hiervoor gebruiken?
#* Kun je tegelijkerwijd ook SHG doen? Zo ja, hoe?
#* Teken de opstelling, leg de onderdelen uit en geef specifiek een detail over het objectief.
#
#* Photoactivatible GFP: Kun je dit gebruiken bij A) Confocal B) PALM C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging
#* Bereken een golfgetal om in een golflengte

=== 18 januari 2016 ===
Hetzelfde examen als 17 januari 2014

=== 15 januari 2016===
Vraag 1: Raman:
#bereken de stokes en anti-stokes van de verschillende fluorescent proteins.
#Welk van de volgende fluorescent proteins kan je gebruiken om TEGELIJK fluorescentie en Raman te bekijken. (Raman is net om geen labelling te moeten doen! Je moet dus werken via anti-stokes en dsRED om tegelijk fluorescentie en Raman te kunnen meten)
#Welke detector en filters zou je gebruiken?

[[Media:Fpintrofigure3.jpg]]

Vraag 2:

Verklaar het volgend mechanisme adhv verschillende technieken gezien in de cursus:
Helicase van hepatitis C bestaat uit 3 delen (groen, blauw en geel). Groen en blauw breken de DNA strand 3 nucleotiden, dan is de spanning tussen gele deel en groen+blauw hoog zodat geel verspring tot aan groene en blauwe deel. Dit start opnieuw. De reactie gebruikt hiervoor ATP.

===21 januari 2014===
#Below you can find the spectral properties of photoactivatable-GFP, a green fluorescent protein that has a dark state (purple absorbance) and a fluorescent state (cyan absorbance and green emission).
Is it possible to use this fluorescent protein for in 1) confocal (2p), 2) PALM (2p) or 3) STED microscopy (2p)? If yes, draw and explain the experimental setup (light source, optics and detectors) and highlight the associated strengths and weaknesses of this type of microscopy to study biological specimens.
You have a laser available in the lab that generates photons with an energy of 20494 cm-1, convert this to a wavelength in nanometres. (2p)[[Bestand:PA-GFP.jpg|418px|thumb|center|PA-GFP]]
#Glut4 is one of the sugar transporter proteins in humans and responsible for the tight regulation of blood glucose concentration. The cartoon below represents part of the complex trafficking pathway of GLUT4, namely an overview of the steps involved in GLUT4 trafficking at the plasma membrane. GSV's interact with a host molecules as they are delivered to the cell periphery and thethered, docked and fused at the plasma membrane. GSV's approach the plasma membrane were they are tethered by actin, the exocyst or TBC1D4, or a combination of these in parallel or in series. The vesicle docks with the plasma membrane as the ternary complex is formed between VAMP2 on the GSV and syntaxin4 and SNAP23 on the plasma membrane. This complex can then facilitate fusion of GSV with the plasma membrane. Devise an experiment that would allow to confirm this sequence of events. (8p)
[[Bestand:GLUT4_pathway.jpg|700px|thumb|center|GLUT4]]

=== 17 januari 2014 ===
# In je labo heb je een commerciÃ«le two-photon microscoop met een 1064 nm laser. Je onderzoekt extracellulaire collageenafzettingen in weefsel van muizen, collageen vertoont SHG. Je wil simultaan ook het cytoskelet en een cytoplasmatisch proteÃ¯ne visualiseren, hiervoor heb je de keuze uit enkele FP's, waarvan de absorbtie- en emissiespectra gegeven zijn.
#* Welke FP's wil je gebruiken en waarom?
#* Beschrijf de set-up die je gaat gebruiken (filters, spiegels, objective lens,...) en waarom.
#* Bereken de energie, in golfgetal, van de fotonen die je laser uitzendt.
# Onderzoek ATP synthase (zie Dynamische Biochemie I), een moleculaire motor die, aangedreven door ATP, protonen transporteert over het celmembraan. Het model van het mechanisme is dat de A-en B-subunits rond eiwit D draaien. Door de symetrie worden stappen van 120Â° gesuggereerd. (het gaat dus over: [http://www.youtube.com/watch?v=PjdPTY1wHdQ] )
#* Bedenk een experiment, gebruik makende van de technieken gezien in de cursus, dat deze hypothese kan bevestigen of verwerpen.

=== 21 januari 2013 ===
# Raman Scattering
#* 2 technieken geven voor het waarnemen van metal nanopartikels (DIC en darkfield)
#* SERS ( je moest adenine en thymine onderscheiden en kreeg hiervoor het ramanspectrum)
#**Bereken de signalen die je bij het spectrum van A en T zult krijgen bij een laser van 488 nm
#**Je kreeg een eenvoudige tekening van een microscoop waarop je dan alle golflengtes, filters en detectoren moest plaatsen en benoemen
#** Welke detector gebruik je hierbij?
# Membraanprocessen visualiseren
#*function (was een Ca2+ kanaal, FRET)
#*Colocolization (FCCS)
#*stoichiometrie (NALMS)
#*diffusion (SPT)
# protein folding
#* De bedoeling was een experiment te ontwerpen op basis van deze cursus waarbij men de dynamica van verkeerd gevouwen proteÃ¯ne kon nagaan maar ook van de juist gevouwen
# Laser Safety
#* welke bril moet je nemen uit de tabel
#* bereken hoeveel power het oog dan bereikt (uit de tabel kreeg je de OD van de bril en je kreeg ook de laser specificaties)
#* Hoeveel fotonen bereiken dan het oog?

=== 20 januari 2012 ===
# Raman scattering
#* Drie golfgetallen en de golflengte van de laser gegeven en dan moet je de golflengte bepalen voor de Stokes en anti-Stokes shift
# Single Particle Tracking
#* je moet een traject tekenen voor een nanopartikel opgenomen van 10 verschillende beelden
#* in detail uitleggen hoe je de analyse doet om er een model aan te correleren
#* de camera frame rate bepalen voor als er twee moleculen passeren waarvan Ã©Ã©n traag (1ÂµmÂ²/s) en Ã©Ã©n snel (10ÂµmÂ²/s)
# Sequencing
#* voor- en nadelen van eerste en tweede generatie vs single molecule
#* is het geschikt voor optical mapping?
#* als je een genoom zou kunnen sequeneren op een volledige dag voor 100â‚¬ zou je daar dan gebruik van maken en waarom?
# Bedenk een experiment om de interactie tussen nanopartikels (20-40 nm) en microtubuli (bij celdeling) te visualiseren (aangezien microtubuli rond 15nm zijn, resolutie microscopy: bv. PALM)
# Energietransfer
#* spectra gegeven van 3 verschillende kleurstoffen en daar de energie transfer van bespreken (FRET, energie hopping, andere buiten FÃ¶rster: Dexter (<1nm) en radiatief)

=== 21 januari 2011 ===

# Waarom mogen er niet te veel fotonen waargenomen worden per excitatiepuls bij Time-correlated single photon couting?
#* ANTW: Stel dat er per puls dat door het staal gaan een paar fotonen geÃ«miteerd worden, dan gaat ge telkens maar de eerste waarnemen (tot een stop leiden) en gaat uw uiteindelijke lifetime korter zijn dan werkelijk het geval is...
#
#* Iets met lasser glasses. Je krijgt gegeven dat je een 2P-experiment doet met een Nd:YAG laser en dan is de vraag welke bril je zou kiezen (4 mogelijkheden gegeven) (ANTW: je gaat na bij welke golflengte de laser werkt en je weet dat je met een hoge intensiteit werkt, dus de OD van de bril moet groot zijn en dan moet je ook een bril voor de geschikte golflengte gebruiken)
#* Vervolgens geven ze dat de laser een puls breedte heeft van 7,5ps, een output van 3W en een frequentie van een aantal MHz. De vraag was dan hoeveel fotonen je per puls krijgt) (ANTW: Ephoton=h*c/Î» (Î» weet je omdat je de laser kent) en dan moet ge uw output delen door uw frequentie om te weten welke output 1 puls heeft en die energie deel je dan door Ephoton)
# Ze labelen een spierproteÃ¯ne van C. elegans met mCherry (genetic labeling).
#* De eerste vraag was met welke microscoop detecteer je of het labelen gelukt is? (ANTW: widefield als je gwn wilt weten of het gelukt is, maar confocal om te zien of het wel in spieren zit)
#* Bedenk een techniek waarbij je geen labels gebruikt (ANTW: 2nd Harmonic generation)
#* Stel een schema op van de set-up waarbij je A en B combineert, zodat je beide simultaan kan meten (ANTW: hier willen ze zien of ge snapt hoe dichroÃ¯c mirror werkt enzo, da ge rekening houdt met de golflengtes en doorlaten en weerkaatsen enzo..)
#* Vervolgens geven ze dat je met raman een proteÃ¯ne waarneemt met een specifiek signaal op 1600cm-1. En ze willen nu weten waar ze het signaal van de laserbeam waarnemen bij SRS als je weet dat de stokes beam op 1064nm is. En geef dan ook waar je het CARS signaal zou waarnemen (ANTW: die 1600 is eigenlijk Î©vibr, en nu weet ge da Ï‰pump= Ï‰stokes+ Î©vibr, hoe dit met die frequenties dan exact in elkaar steekt weet ik nimeer, wnt ik had deze vraag ni juist en ze hebbe da dan zo snel proberen uit te leggenâ€¦ eens ge dan Ï‰pump weet, kunt ge het signaal voor CARS bepalen met 2Ï‰pump-Ï‰stokes)
#* Voordelen van CARS tov spontane Raman (ANTW: vrij letterlijk in cursus :p)
#* Teken weer een schema maar nu met het extra ding van raman
# Is een high NA nodig voor FCS? (ANTW: ja, omdat ge hierdoor beter kunt focussen in 1 vlak, het draagt bij tot een kleiner confocul volume, want minder grote hoogte (Z-as), of toch iets in die aardâ€¦)
# Bespreek met welke technieken je dynamica kan bestuderen en wat is het verschil tussen die technieken (ANTW: FCS, SPT en FRAP kort uitleggen, en het verschil is da ge bij FCS en FRAP een gemiddelde life-time gaat berekenen en bij SPT. Bij FCS kunt ge tov FRAP wel eventueel een onderscheid maken tussen populaties, dit is bij FRAP helemaal niet mogelijk)
#
#* Ge kreeg een figuurtje van een holiday junctie met fluoroforen en er was een evenwicht tussen 2 conformationele toestanden. Dan kwam ge te weten dat CY5 een acceptor is van CY3 en dat CY5.5 en acceptor is van CY5. Er gaat FRET optreden tussen deze fluoroforen en ge moest een schema geven van de Intensiteit tov de tijd met het gegeven da ge eerst 20s conformatie 1 had en dan 20s conformatie 2 om trg 20s conformatie 1 te hebben en dan treed er bleaching op van CY5.5 en na nog eens 10s treed er bleaching op van CY3, maar het moeilijke eraan was dat ge het volgende kreeg: de lifetime van CY3 is 5ns, die van CY5 is 4ns en die van CY5.5 is 7. In conformatie 1 zijn de lifetimes de volgende CY3:1ns, CY5 2ns en C5.5:7ns, in conformatie 2 verandert dan enkel de lifetime van CY3 en deze wordt 3ns. (ANTW: de bedoeling is da ge hier efficienties uitrekent (E=1-(Ï„DA/Ï„D) en zo dus relatieve intensiteiten gaat uitzetten, achteraf gezien wel een simpele oplossing, maar er zijn er maar weinig die dit haddenâ€¦)
#* Krijgt ge hetzelfe resultaat als je CY5 en CY5.5 vervangt door 2 DRONPAs? En krijg je hetzelfde resultaat als je beide vervangt door 2KAEDEs? (ANTW: Doordat je vervangt door 2 keer hetzelfde ga je uiteraard niet hetzelfde zien. DRONPA is photoswitchable en zo kan je FRET combineren met aan en uit zetten van DRONPA, KAEDE is photoconverteble en zo kan je FRET combineren met switchen tss 2 kleuren van KAEDE)
# Hoeveel labels moet een 2Âµm actinefilament bevatten opdat ge het met 10nm zou kunnen waarnemen? (ANTW: 2000nm/10nm=200 ïƒ je hebt minstens het dubbel hiervan nodig (400), wnt je wilt weten wat er zich tussen labels dat op 10nm van elkaar staan afspeelt, dus minstens om de 5nm een label zetten)

=== 1 september 2010 ===

[[Bestand:HIV_replication_cycle.gif|150px|thumb|right|HIV replication cycle]]
# (12 punten) Afbeelding HIV replicatieyclus gegeven. Bedenk experimenten gebaseerd op technieken die we in de cursus gezien hebben (en uiteindelijk ook biochemische technieken) om onderstaande onderzoeksvragen te behandelen. Hoe kan je:
#* docking van het virus visualiseren?
#* bewijzen dat docking al dan niet receptor-gemedieerd is?
#* aantonen of transport van het viraal DNA gebeurt door actief transport of door vrije diffusie?
#* bewijzen dat het viraal DNA door nucleaire poriÃ«n wordt getransporteerd?
#* bewijzen dat het viraal DNA geÃ¯ntegreerd is in het cellulaire DNA?
#* bewijzen dat er nieuwe virale eiwitten worden aangemaakt?
# (4 punten) Is de volgende bewering correct of niet?: "Voor het bestuderen van moleculaire interacties is FCS een betere techniek dan BiFC." Motiveer je antwoord.
# (4 punten) Hoe kan men het contrast in lichtmicroscopie verbeteren?

=== 18 januari 2010 ===

# Hoe kan je DNA sequencen met behulp van raman spectroscopie? Stel een experimentele setup voor.
# Waar moet je op letten bij fluorescentie in vivo? Wat zijn de problemen, hoe kan je die oplossen? Welke technieken zijn geschikt en wat zijn voordelen/nadelen?
# Geef manieren om contrast in optische microscopie te verhogen.
# Signaalpathway gegeven van een G-proteine en adenyl cyclase (in membraan). Hoe kan je de interactie tussen G-proteine en adenyl cyclase onderzoeken? Is dit systeem geschikt voor single molecule? Geef de single molecule time traces.
# Verschil tussen anti-stokes raman (direct meten) en CARS.
# Ontwerp een experiment om de toxiciteit van nanoparticles te onderzoeken. Vaak wordt gesuggereerd dat nanoparticles direct interfereren met de celcyclus. Hoe kan je dat onderzoeken?
# Vraagje over FRAP van membraanproteine. Berekenen van diffusiecoÃ«fficient. (500 nm diameter bleach spot + half recovery op x s gegeven).

=== 15 januari 2010 ===

# Voordelen van single molecule DNA sequencing? Verschil tussen methode met exonuclease en met polymerase? Methode voor single molecule DNA sequencing zonder fluorescentie? (4 ptn)
# Bestuderen van protein folding. Vaststellen van 'rare misfolding' en 'folding'? Kinetica van folding en misfolding? Probability van misfolding? Stel een experiment op met de geziene technieken.) (4 ptn)
# Is het mogelijk om de temperatuur te bepalen met Raman Spectroscopy? (2 ptn)
# Conformatieveranderingen van <1nm bestuderen (3 ptn)
# Technieken om single molecules te bestuderen zonder fluo (2 ptn)
# Bestuderen van de dynamica van actinefilamenten (3 ptn)
# Foto's van fluo-gekleurde cellen: multi-exposure view, intensiteit, lifetime image: wordt elk fluorofoor correct geÃ¯dentificeerd in legende? Hoe werd lifetime image gemaakt? (2 ptn)

=== 30 januari 2009 ===

# Gegeven een figuur van DNA-sequentie-methode. Een proefopstelling daarvoor tekenen, en karakteristieken van de dyes en de optische componenten geven.
# Wat is de PSF. Kan je die veranderen? Hoe?
# Vreemde vraag van halve bladzijde. Kwam er op neer dat ze het zelf nog niet zo goed wisten en dat een E. coli ongeveer de grootte van de focal spot heeft.
# Drie vraagjes van Visser. Bijna letterlijk.
# Nog drie vraagjes van Visser. Al bijna even letterlijk.
# Een polynucleotide (<20nt) is aan de ene kant gemerkt met een dye (MB121 of zo). Er zijn een paar mutaties gemaakt: er werd op bepaalde plaatsen G (dat in de "wt" afwezig was) ingebracht. Resultaat: lifetime vermindert, abs/em niet (rond de 600nm, G zit rond 300nm is gegeven). Wat gebeurt er en hoe kan je het kwantitatief bestuderen?

=== 26 januari 2009 ===

# Welke methode zou je gebruiken om chaperone gemedieerd folding proces te onderzoeken, bespreek kort de theoratische achtergrond. (FRET) Stel 2 mogelijke labelingsstrategieen voor. Kan dit ook bestudeerd worden via elektron transfer, hoe ziet een single molecule trace er dan uit en dergelijke.
# Hoe zou je de volgende processen bestuderen: Ca2+ release in cellen, diffusie in membraan, colocalisatie, stoichiometrie.
# Bespreek de uitspraak 'PALM en STED zijn volledig gebaseerd op hetzelfde principe'
# Hoe kan je achtergrond/autofluorescentie vermijden of bestrijden? Hoe verhoog je contrast in optische microscopie (wees volledig)
# Twee kleinere vraagjes over FRET-FRAP experiment met de androgen receptor
# Drie kleinere vraagjes rond FLIM

=== 18 januari 2008 ===

# (4punten) De eerste vraag ging over een RET waarbij drie fluorophoren in twee conformaties voorkomen en naargelang de conformatie was er tussen twee van de drie RET en dan moest je daar een diagram van tekenen: Fluorescentie intensiteit ifv de tijd. Als extra moest je dan ook nog eens een diagram tekenen als er RET was tussen alle drie. Bij deze vraag moest je telkens rekening houden met de efficientie van transfer.
# (3punten) Een schema dat je moest vervolledigen: je kreeg de technieken FCS, FRAP, FCCS en FRET-FLIM en dan moest je bij alle zeggen of je er dynamics mee kon bestuderen, of je naar moleculaire interacties kon kijken, de conc. range die nodig is voor de techniek en de tijdsschaal waarop gekeken wordt.
# (2punten) Als je met een microscoop met twee kanalen co-localizatie waarneemt, heb je dan interactie tussen beide moleculen?
# (2punten) We hadden in de les twee artikels behandeld van Sunexie (of zoiets)
#* Waarom wordt het proteine onder de lac promotor tot expressie gebracht?
#* Waarom veranker je YFP aan een membraanproteine?
# (3punten) Wat is de Point spread function (PSF) in microscopie. Kun je deze veranderen en zoja, hoe?
# (4punten) Hoe kun je autofluorescentie vermijden/overkomen vanuit het oogpunt van microscopie?
# (2punten) Je hebt een bepaalde dye die aan het 3' uiteinde van een oligonucleotide wordt gehangen. (dan had je een tabelletje met 4 oligonucleotiden en dan de levensduur van de dye) Als er zich een Guanine in de buurt van de dye komt, dan wordt de levensduur van de dye plots veel korter. Het absorptiemaximum van de dye ligt rond 650nm en het absorptieminimum rond 680. Nucleotiden absorberen enkel op golflengtes kleiner dan 330nm.
#* Van welk proces is hier sprake?
#* Welke quantitatieve informatie kun je hieruit afleiden?</text>

Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy

2022-01-28T15:28:46Z

R0837412: /* Examenvragen */

[[Categorie: Mabb]]
[[Categorie: Machemie]]

== Vakinformatie ==
Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy
Boeiend vak, gegeven door Johan Hofkens, Maarten Roeffaers, Elke Debroye en Jelle Hendrix.
Vak telt ook soort van (niet verplichte) practicumsessies, waarin je kort ingeleid wordt tot diverse microscopische/fluorescentie-technieken.
Mondeling examen dat open boek is, waarbij je alles (inclusief laptop met internet) mag gebruiken.

ECTS-fiche: https://onderwijsaanbod.kuleuven.be/syllabi/e/G0G59AE.htm

== Examenvragen ==

===Exam January 2022===
Exam was composed of two parts:
First part (Hofkens): Studies have seen that applying a functional substrate makes G-protein couple receptor dimerize and a quicker vesicle formation (recycling of G-protein coupled receptor). With a truncated version of the substrate, you get a slower vesicle formation, and no dimerisation.
Divided in two exercises:
# (5 points) Describe how would you observe that the substrate produces dimerisation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers. (For example: FRET in combination with TIRF).
# (5 points) How would you prove that there is downstream signal transduction, and you want to observe the process of vesicle formation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers.

Second part (Maarten) (6 points): Carbon nanotubes are claimed to be able to enter cancer cells and deliver a drug in cancer tissue. You doubt it, and you want to check if this is true.
What approach would you use? Motivate your answer. Will you be using tags? Justify why you do or do not use and motivate your answer. (For example: Raman microscopy with use of Raman tag Alkyne).

===Mededeling januari 2021===
Door een crash van de wiki zijn verschillende afbeeldingen en bestanden verloren gegaan. Wanneer je op een link klikt en er dus geen bestand opent, is dit spijtig genoeg niet meer beschikbaar op de wiki. Er is dus niks mis met jouw computer of inloggegevens.

Due to a crash of the wiki certain images and documents have been lost. When you try opening them with the link provided, they will not show anymore. There is nothing wrong with your computer or credentials. This is a general problem.
=== 14 januari 2019 NM ===
#Vraag van Hofkens: geef technieken om signaling via EGF-EGFR-Gbr2-Sos-Ras-Raf te bestuderen (vb FRET, STED, FCS) + geef technieken om uit te zoeken of EGFR nog een signaling platform is nadat het in een clathrin-coated vesicle is geïntegreerd (vb FRET). Veel meer uitleg werd gegeven in de opgave.
#Vraag Maarten: Photoactivatible GFP (spectrum gegeven): Kun je dit gebruiken bij:
#*A) Confocal
#*B) PALM
#*C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging. (antwoord: confocal gaat maar niet zo nuttig; ja voor PALM + teken met alle lenzen, dichroic, camera; niet voor STED/RESOLFT want kan je niet terug uitschakelen)

=== 19 januari 2018===
#
#* Er is een excitatie- en emissiespectrum van verschillende FPs gegeven en je hebt een microscoop met lasers 488, 600zoveel en 1050nm. Welke fluorofoor zou je gebruiken om te meten in C. elegans?
#* Je wilt de interactie tussen eiwit A, gelabeld met je antwoord uit 1.1, en eiwit B meten. Hoe zou je dat doen? Welk fluorofoor zou je hiervoor gebruiken?
#* Kun je tegelijkerwijd ook SHG doen? Zo ja, hoe?
#* Teken de opstelling, leg de onderdelen uit en geef specifiek een detail over het objectief.
#
#* Photoactivatible GFP: Kun je dit gebruiken bij A) Confocal B) PALM C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging
#* Bereken een golfgetal om in een golflengte

=== 18 januari 2016 ===
Hetzelfde examen als 17 januari 2014

=== 15 januari 2016===
Vraag 1: Raman:
#bereken de stokes en anti-stokes van de verschillende fluorescent proteins.
#Welk van de volgende fluorescent proteins kan je gebruiken om TEGELIJK fluorescentie en Raman te bekijken. (Raman is net om geen labelling te moeten doen! Je moet dus werken via anti-stokes en dsRED om tegelijk fluorescentie en Raman te kunnen meten)
#Welke detector en filters zou je gebruiken?

[[Media:Fpintrofigure3.jpg]]

Vraag 2:

Verklaar het volgend mechanisme adhv verschillende technieken gezien in de cursus:
Helicase van hepatitis C bestaat uit 3 delen (groen, blauw en geel). Groen en blauw breken de DNA strand 3 nucleotiden, dan is de spanning tussen gele deel en groen+blauw hoog zodat geel verspring tot aan groene en blauwe deel. Dit start opnieuw. De reactie gebruikt hiervoor ATP.

===21 januari 2014===
#Below you can find the spectral properties of photoactivatable-GFP, a green fluorescent protein that has a dark state (purple absorbance) and a fluorescent state (cyan absorbance and green emission).
Is it possible to use this fluorescent protein for in 1) confocal (2p), 2) PALM (2p) or 3) STED microscopy (2p)? If yes, draw and explain the experimental setup (light source, optics and detectors) and highlight the associated strengths and weaknesses of this type of microscopy to study biological specimens.
You have a laser available in the lab that generates photons with an energy of 20494 cm-1, convert this to a wavelength in nanometres. (2p)[[Bestand:PA-GFP.jpg|418px|thumb|center|PA-GFP]]
#Glut4 is one of the sugar transporter proteins in humans and responsible for the tight regulation of blood glucose concentration. The cartoon below represents part of the complex trafficking pathway of GLUT4, namely an overview of the steps involved in GLUT4 trafficking at the plasma membrane. GSV's interact with a host molecules as they are delivered to the cell periphery and thethered, docked and fused at the plasma membrane. GSV's approach the plasma membrane were they are tethered by actin, the exocyst or TBC1D4, or a combination of these in parallel or in series. The vesicle docks with the plasma membrane as the ternary complex is formed between VAMP2 on the GSV and syntaxin4 and SNAP23 on the plasma membrane. This complex can then facilitate fusion of GSV with the plasma membrane. Devise an experiment that would allow to confirm this sequence of events. (8p)
[[Bestand:GLUT4_pathway.jpg|700px|thumb|center|GLUT4]]

=== 17 januari 2014 ===
# In je labo heb je een commerciÃ«le two-photon microscoop met een 1064 nm laser. Je onderzoekt extracellulaire collageenafzettingen in weefsel van muizen, collageen vertoont SHG. Je wil simultaan ook het cytoskelet en een cytoplasmatisch proteÃ¯ne visualiseren, hiervoor heb je de keuze uit enkele FP's, waarvan de absorbtie- en emissiespectra gegeven zijn.
#* Welke FP's wil je gebruiken en waarom?
#* Beschrijf de set-up die je gaat gebruiken (filters, spiegels, objective lens,...) en waarom.
#* Bereken de energie, in golfgetal, van de fotonen die je laser uitzendt.
# Onderzoek ATP synthase (zie Dynamische Biochemie I), een moleculaire motor die, aangedreven door ATP, protonen transporteert over het celmembraan. Het model van het mechanisme is dat de A-en B-subunits rond eiwit D draaien. Door de symetrie worden stappen van 120Â° gesuggereerd. (het gaat dus over: [http://www.youtube.com/watch?v=PjdPTY1wHdQ] )
#* Bedenk een experiment, gebruik makende van de technieken gezien in de cursus, dat deze hypothese kan bevestigen of verwerpen.

=== 21 januari 2013 ===
# Raman Scattering
#* 2 technieken geven voor het waarnemen van metal nanopartikels (DIC en darkfield)
#* SERS ( je moest adenine en thymine onderscheiden en kreeg hiervoor het ramanspectrum)
#**Bereken de signalen die je bij het spectrum van A en T zult krijgen bij een laser van 488 nm
#**Je kreeg een eenvoudige tekening van een microscoop waarop je dan alle golflengtes, filters en detectoren moest plaatsen en benoemen
#** Welke detector gebruik je hierbij?
# Membraanprocessen visualiseren
#*function (was een Ca2+ kanaal, FRET)
#*Colocolization (FCCS)
#*stoichiometrie (NALMS)
#*diffusion (SPT)
# protein folding
#* De bedoeling was een experiment te ontwerpen op basis van deze cursus waarbij men de dynamica van verkeerd gevouwen proteÃ¯ne kon nagaan maar ook van de juist gevouwen
# Laser Safety
#* welke bril moet je nemen uit de tabel
#* bereken hoeveel power het oog dan bereikt (uit de tabel kreeg je de OD van de bril en je kreeg ook de laser specificaties)
#* Hoeveel fotonen bereiken dan het oog?

=== 20 januari 2012 ===
# Raman scattering
#* Drie golfgetallen en de golflengte van de laser gegeven en dan moet je de golflengte bepalen voor de Stokes en anti-Stokes shift
# Single Particle Tracking
#* je moet een traject tekenen voor een nanopartikel opgenomen van 10 verschillende beelden
#* in detail uitleggen hoe je de analyse doet om er een model aan te correleren
#* de camera frame rate bepalen voor als er twee moleculen passeren waarvan Ã©Ã©n traag (1ÂµmÂ²/s) en Ã©Ã©n snel (10ÂµmÂ²/s)
# Sequencing
#* voor- en nadelen van eerste en tweede generatie vs single molecule
#* is het geschikt voor optical mapping?
#* als je een genoom zou kunnen sequeneren op een volledige dag voor 100â‚¬ zou je daar dan gebruik van maken en waarom?
# Bedenk een experiment om de interactie tussen nanopartikels (20-40 nm) en microtubuli (bij celdeling) te visualiseren (aangezien microtubuli rond 15nm zijn, resolutie microscopy: bv. PALM)
# Energietransfer
#* spectra gegeven van 3 verschillende kleurstoffen en daar de energie transfer van bespreken (FRET, energie hopping, andere buiten FÃ¶rster: Dexter (<1nm) en radiatief)

=== 21 januari 2011 ===

# Waarom mogen er niet te veel fotonen waargenomen worden per excitatiepuls bij Time-correlated single photon couting?
#* ANTW: Stel dat er per puls dat door het staal gaan een paar fotonen geÃ«miteerd worden, dan gaat ge telkens maar de eerste waarnemen (tot een stop leiden) en gaat uw uiteindelijke lifetime korter zijn dan werkelijk het geval is...
#
#* Iets met lasser glasses. Je krijgt gegeven dat je een 2P-experiment doet met een Nd:YAG laser en dan is de vraag welke bril je zou kiezen (4 mogelijkheden gegeven) (ANTW: je gaat na bij welke golflengte de laser werkt en je weet dat je met een hoge intensiteit werkt, dus de OD van de bril moet groot zijn en dan moet je ook een bril voor de geschikte golflengte gebruiken)
#* Vervolgens geven ze dat de laser een puls breedte heeft van 7,5ps, een output van 3W en een frequentie van een aantal MHz. De vraag was dan hoeveel fotonen je per puls krijgt) (ANTW: Ephoton=h*c/Î» (Î» weet je omdat je de laser kent) en dan moet ge uw output delen door uw frequentie om te weten welke output 1 puls heeft en die energie deel je dan door Ephoton)
# Ze labelen een spierproteÃ¯ne van C. elegans met mCherry (genetic labeling).
#* De eerste vraag was met welke microscoop detecteer je of het labelen gelukt is? (ANTW: widefield als je gwn wilt weten of het gelukt is, maar confocal om te zien of het wel in spieren zit)
#* Bedenk een techniek waarbij je geen labels gebruikt (ANTW: 2nd Harmonic generation)
#* Stel een schema op van de set-up waarbij je A en B combineert, zodat je beide simultaan kan meten (ANTW: hier willen ze zien of ge snapt hoe dichroÃ¯c mirror werkt enzo, da ge rekening houdt met de golflengtes en doorlaten en weerkaatsen enzo..)
#* Vervolgens geven ze dat je met raman een proteÃ¯ne waarneemt met een specifiek signaal op 1600cm-1. En ze willen nu weten waar ze het signaal van de laserbeam waarnemen bij SRS als je weet dat de stokes beam op 1064nm is. En geef dan ook waar je het CARS signaal zou waarnemen (ANTW: die 1600 is eigenlijk Î©vibr, en nu weet ge da Ï‰pump= Ï‰stokes+ Î©vibr, hoe dit met die frequenties dan exact in elkaar steekt weet ik nimeer, wnt ik had deze vraag ni juist en ze hebbe da dan zo snel proberen uit te leggenâ€¦ eens ge dan Ï‰pump weet, kunt ge het signaal voor CARS bepalen met 2Ï‰pump-Ï‰stokes)
#* Voordelen van CARS tov spontane Raman (ANTW: vrij letterlijk in cursus :p)
#* Teken weer een schema maar nu met het extra ding van raman
# Is een high NA nodig voor FCS? (ANTW: ja, omdat ge hierdoor beter kunt focussen in 1 vlak, het draagt bij tot een kleiner confocul volume, want minder grote hoogte (Z-as), of toch iets in die aardâ€¦)
# Bespreek met welke technieken je dynamica kan bestuderen en wat is het verschil tussen die technieken (ANTW: FCS, SPT en FRAP kort uitleggen, en het verschil is da ge bij FCS en FRAP een gemiddelde life-time gaat berekenen en bij SPT. Bij FCS kunt ge tov FRAP wel eventueel een onderscheid maken tussen populaties, dit is bij FRAP helemaal niet mogelijk)
#
#* Ge kreeg een figuurtje van een holiday junctie met fluoroforen en er was een evenwicht tussen 2 conformationele toestanden. Dan kwam ge te weten dat CY5 een acceptor is van CY3 en dat CY5.5 en acceptor is van CY5. Er gaat FRET optreden tussen deze fluoroforen en ge moest een schema geven van de Intensiteit tov de tijd met het gegeven da ge eerst 20s conformatie 1 had en dan 20s conformatie 2 om trg 20s conformatie 1 te hebben en dan treed er bleaching op van CY5.5 en na nog eens 10s treed er bleaching op van CY3, maar het moeilijke eraan was dat ge het volgende kreeg: de lifetime van CY3 is 5ns, die van CY5 is 4ns en die van CY5.5 is 7. In conformatie 1 zijn de lifetimes de volgende CY3:1ns, CY5 2ns en C5.5:7ns, in conformatie 2 verandert dan enkel de lifetime van CY3 en deze wordt 3ns. (ANTW: de bedoeling is da ge hier efficienties uitrekent (E=1-(Ï„DA/Ï„D) en zo dus relatieve intensiteiten gaat uitzetten, achteraf gezien wel een simpele oplossing, maar er zijn er maar weinig die dit haddenâ€¦)
#* Krijgt ge hetzelfe resultaat als je CY5 en CY5.5 vervangt door 2 DRONPAs? En krijg je hetzelfde resultaat als je beide vervangt door 2KAEDEs? (ANTW: Doordat je vervangt door 2 keer hetzelfde ga je uiteraard niet hetzelfde zien. DRONPA is photoswitchable en zo kan je FRET combineren met aan en uit zetten van DRONPA, KAEDE is photoconverteble en zo kan je FRET combineren met switchen tss 2 kleuren van KAEDE)
# Hoeveel labels moet een 2Âµm actinefilament bevatten opdat ge het met 10nm zou kunnen waarnemen? (ANTW: 2000nm/10nm=200 ïƒ je hebt minstens het dubbel hiervan nodig (400), wnt je wilt weten wat er zich tussen labels dat op 10nm van elkaar staan afspeelt, dus minstens om de 5nm een label zetten)

=== 1 september 2010 ===

[[Bestand:HIV_replication_cycle.gif|150px|thumb|right|HIV replication cycle]]
# (12 punten) Afbeelding HIV replicatieyclus gegeven. Bedenk experimenten gebaseerd op technieken die we in de cursus gezien hebben (en uiteindelijk ook biochemische technieken) om onderstaande onderzoeksvragen te behandelen. Hoe kan je:
#* docking van het virus visualiseren?
#* bewijzen dat docking al dan niet receptor-gemedieerd is?
#* aantonen of transport van het viraal DNA gebeurt door actief transport of door vrije diffusie?
#* bewijzen dat het viraal DNA door nucleaire poriÃ«n wordt getransporteerd?
#* bewijzen dat het viraal DNA geÃ¯ntegreerd is in het cellulaire DNA?
#* bewijzen dat er nieuwe virale eiwitten worden aangemaakt?
# (4 punten) Is de volgende bewering correct of niet?: "Voor het bestuderen van moleculaire interacties is FCS een betere techniek dan BiFC." Motiveer je antwoord.
# (4 punten) Hoe kan men het contrast in lichtmicroscopie verbeteren?

=== 18 januari 2010 ===

# Hoe kan je DNA sequencen met behulp van raman spectroscopie? Stel een experimentele setup voor.
# Waar moet je op letten bij fluorescentie in vivo? Wat zijn de problemen, hoe kan je die oplossen? Welke technieken zijn geschikt en wat zijn voordelen/nadelen?
# Geef manieren om contrast in optische microscopie te verhogen.
# Signaalpathway gegeven van een G-proteine en adenyl cyclase (in membraan). Hoe kan je de interactie tussen G-proteine en adenyl cyclase onderzoeken? Is dit systeem geschikt voor single molecule? Geef de single molecule time traces.
# Verschil tussen anti-stokes raman (direct meten) en CARS.
# Ontwerp een experiment om de toxiciteit van nanoparticles te onderzoeken. Vaak wordt gesuggereerd dat nanoparticles direct interfereren met de celcyclus. Hoe kan je dat onderzoeken?
# Vraagje over FRAP van membraanproteine. Berekenen van diffusiecoÃ«fficient. (500 nm diameter bleach spot + half recovery op x s gegeven).

=== 15 januari 2010 ===

# Voordelen van single molecule DNA sequencing? Verschil tussen methode met exonuclease en met polymerase? Methode voor single molecule DNA sequencing zonder fluorescentie? (4 ptn)
# Bestuderen van protein folding. Vaststellen van 'rare misfolding' en 'folding'? Kinetica van folding en misfolding? Probability van misfolding? Stel een experiment op met de geziene technieken.) (4 ptn)
# Is het mogelijk om de temperatuur te bepalen met Raman Spectroscopy? (2 ptn)
# Conformatieveranderingen van <1nm bestuderen (3 ptn)
# Technieken om single molecules te bestuderen zonder fluo (2 ptn)
# Bestuderen van de dynamica van actinefilamenten (3 ptn)
# Foto's van fluo-gekleurde cellen: multi-exposure view, intensiteit, lifetime image: wordt elk fluorofoor correct geÃ¯dentificeerd in legende? Hoe werd lifetime image gemaakt? (2 ptn)

=== 30 januari 2009 ===

# Gegeven een figuur van DNA-sequentie-methode. Een proefopstelling daarvoor tekenen, en karakteristieken van de dyes en de optische componenten geven.
# Wat is de PSF. Kan je die veranderen? Hoe?
# Vreemde vraag van halve bladzijde. Kwam er op neer dat ze het zelf nog niet zo goed wisten en dat een E. coli ongeveer de grootte van de focal spot heeft.
# Drie vraagjes van Visser. Bijna letterlijk.
# Nog drie vraagjes van Visser. Al bijna even letterlijk.
# Een polynucleotide (<20nt) is aan de ene kant gemerkt met een dye (MB121 of zo). Er zijn een paar mutaties gemaakt: er werd op bepaalde plaatsen G (dat in de "wt" afwezig was) ingebracht. Resultaat: lifetime vermindert, abs/em niet (rond de 600nm, G zit rond 300nm is gegeven). Wat gebeurt er en hoe kan je het kwantitatief bestuderen?

=== 26 januari 2009 ===

# Welke methode zou je gebruiken om chaperone gemedieerd folding proces te onderzoeken, bespreek kort de theoratische achtergrond. (FRET) Stel 2 mogelijke labelingsstrategieen voor. Kan dit ook bestudeerd worden via elektron transfer, hoe ziet een single molecule trace er dan uit en dergelijke.
# Hoe zou je de volgende processen bestuderen: Ca2+ release in cellen, diffusie in membraan, colocalisatie, stoichiometrie.
# Bespreek de uitspraak 'PALM en STED zijn volledig gebaseerd op hetzelfde principe'
# Hoe kan je achtergrond/autofluorescentie vermijden of bestrijden? Hoe verhoog je contrast in optische microscopie (wees volledig)
# Twee kleinere vraagjes over FRET-FRAP experiment met de androgen receptor
# Drie kleinere vraagjes rond FLIM

=== 18 januari 2008 ===

# (4punten) De eerste vraag ging over een RET waarbij drie fluorophoren in twee conformaties voorkomen en naargelang de conformatie was er tussen twee van de drie RET en dan moest je daar een diagram van tekenen: Fluorescentie intensiteit ifv de tijd. Als extra moest je dan ook nog eens een diagram tekenen als er RET was tussen alle drie. Bij deze vraag moest je telkens rekening houden met de efficientie van transfer.
# (3punten) Een schema dat je moest vervolledigen: je kreeg de technieken FCS, FRAP, FCCS en FRET-FLIM en dan moest je bij alle zeggen of je er dynamics mee kon bestuderen, of je naar moleculaire interacties kon kijken, de conc. range die nodig is voor de techniek en de tijdsschaal waarop gekeken wordt.
# (2punten) Als je met een microscoop met twee kanalen co-localizatie waarneemt, heb je dan interactie tussen beide moleculen?
# (2punten) We hadden in de les twee artikels behandeld van Sunexie (of zoiets)
#* Waarom wordt het proteine onder de lac promotor tot expressie gebracht?
#* Waarom veranker je YFP aan een membraanproteine?
# (3punten) Wat is de Point spread function (PSF) in microscopie. Kun je deze veranderen en zoja, hoe?
# (4punten) Hoe kun je autofluorescentie vermijden/overkomen vanuit het oogpunt van microscopie?
# (2punten) Je hebt een bepaalde dye die aan het 3' uiteinde van een oligonucleotide wordt gehangen. (dan had je een tabelletje met 4 oligonucleotiden en dan de levensduur van de dye) Als er zich een Guanine in de buurt van de dye komt, dan wordt de levensduur van de dye plots veel korter. Het absorptiemaximum van de dye ligt rond 650nm en het absorptieminimum rond 680. Nucleotiden absorberen enkel op golflengtes kleiner dan 330nm.
#* Van welk proces is hier sprake?
#* Welke quantitatieve informatie kun je hieruit afleiden?</text>

Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy

2022-01-28T15:28:16Z

R0837412: /* Exam January 2022 */

[[Categorie: Mabb]]
[[Categorie: Machemie]]

== Vakinformatie ==
Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy
Boeiend vak, gegeven door Johan Hofkens, Maarten Roeffaers, Elke Debroye en Jelle Hendrix.
Vak telt ook soort van (niet verplichte) practicumsessies, waarin je kort ingeleid wordt tot diverse microscopische/fluorescentie-technieken.
Mondeling examen dat open boek is, waarbij je alles (inclusief laptop met internet) mag gebruiken.

ECTS-fiche: https://onderwijsaanbod.kuleuven.be/syllabi/e/G0G59AE.htm

== Examenvragen ==

===Exam January 2022===
Exam was composed of two parts:
First part (Hofkens): Studies have seen that applying a functional substrate makes G-protein couple receptor dimerize and a quicker vesicle formation (recycling of G-protein coupled receptor). With a truncated version of the substrate, you get a slower vesicle formation, and no dimerisation.
Divided in two exercises:
#1) (5 points) Describe how would you observe that the substrate produces dimerisation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers. (For example: FRET in combination with TIRF).
#2) (5 points) How would you prove that there is downstream signal transduction, and you want to observe the process of vesicle formation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers.

Second part (Maarten) (6 points): Carbon nanotubes are claimed to be able to enter cancer cells and deliver a drug in cancer tissue. You doubt it, and you want to check if this is true.
What approach would you use? Motivate your answer. Will you be using tags? Justify why you do or do not use and motivate your answer. (For example: Raman microscopy with use of Raman tag Alkyne).

===Mededeling januari 2021===
Door een crash van de wiki zijn verschillende afbeeldingen en bestanden verloren gegaan. Wanneer je op een link klikt en er dus geen bestand opent, is dit spijtig genoeg niet meer beschikbaar op de wiki. Er is dus niks mis met jouw computer of inloggegevens.

Due to a crash of the wiki certain images and documents have been lost. When you try opening them with the link provided, they will not show anymore. There is nothing wrong with your computer or credentials. This is a general problem.
=== 14 januari 2019 NM ===
#Vraag van Hofkens: geef technieken om signaling via EGF-EGFR-Gbr2-Sos-Ras-Raf te bestuderen (vb FRET, STED, FCS) + geef technieken om uit te zoeken of EGFR nog een signaling platform is nadat het in een clathrin-coated vesicle is geïntegreerd (vb FRET). Veel meer uitleg werd gegeven in de opgave.
#Vraag Maarten: Photoactivatible GFP (spectrum gegeven): Kun je dit gebruiken bij:
#*A) Confocal
#*B) PALM
#*C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging. (antwoord: confocal gaat maar niet zo nuttig; ja voor PALM + teken met alle lenzen, dichroic, camera; niet voor STED/RESOLFT want kan je niet terug uitschakelen)

=== 19 januari 2018===
#
#* Er is een excitatie- en emissiespectrum van verschillende FPs gegeven en je hebt een microscoop met lasers 488, 600zoveel en 1050nm. Welke fluorofoor zou je gebruiken om te meten in C. elegans?
#* Je wilt de interactie tussen eiwit A, gelabeld met je antwoord uit 1.1, en eiwit B meten. Hoe zou je dat doen? Welk fluorofoor zou je hiervoor gebruiken?
#* Kun je tegelijkerwijd ook SHG doen? Zo ja, hoe?
#* Teken de opstelling, leg de onderdelen uit en geef specifiek een detail over het objectief.
#
#* Photoactivatible GFP: Kun je dit gebruiken bij A) Confocal B) PALM C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging
#* Bereken een golfgetal om in een golflengte

=== 18 januari 2016 ===
Hetzelfde examen als 17 januari 2014

=== 15 januari 2016===
Vraag 1: Raman:
#bereken de stokes en anti-stokes van de verschillende fluorescent proteins.
#Welk van de volgende fluorescent proteins kan je gebruiken om TEGELIJK fluorescentie en Raman te bekijken. (Raman is net om geen labelling te moeten doen! Je moet dus werken via anti-stokes en dsRED om tegelijk fluorescentie en Raman te kunnen meten)
#Welke detector en filters zou je gebruiken?

[[Media:Fpintrofigure3.jpg]]

Vraag 2:

Verklaar het volgend mechanisme adhv verschillende technieken gezien in de cursus:
Helicase van hepatitis C bestaat uit 3 delen (groen, blauw en geel). Groen en blauw breken de DNA strand 3 nucleotiden, dan is de spanning tussen gele deel en groen+blauw hoog zodat geel verspring tot aan groene en blauwe deel. Dit start opnieuw. De reactie gebruikt hiervoor ATP.

===21 januari 2014===
#Below you can find the spectral properties of photoactivatable-GFP, a green fluorescent protein that has a dark state (purple absorbance) and a fluorescent state (cyan absorbance and green emission).
Is it possible to use this fluorescent protein for in 1) confocal (2p), 2) PALM (2p) or 3) STED microscopy (2p)? If yes, draw and explain the experimental setup (light source, optics and detectors) and highlight the associated strengths and weaknesses of this type of microscopy to study biological specimens.
You have a laser available in the lab that generates photons with an energy of 20494 cm-1, convert this to a wavelength in nanometres. (2p)[[Bestand:PA-GFP.jpg|418px|thumb|center|PA-GFP]]
#Glut4 is one of the sugar transporter proteins in humans and responsible for the tight regulation of blood glucose concentration. The cartoon below represents part of the complex trafficking pathway of GLUT4, namely an overview of the steps involved in GLUT4 trafficking at the plasma membrane. GSV's interact with a host molecules as they are delivered to the cell periphery and thethered, docked and fused at the plasma membrane. GSV's approach the plasma membrane were they are tethered by actin, the exocyst or TBC1D4, or a combination of these in parallel or in series. The vesicle docks with the plasma membrane as the ternary complex is formed between VAMP2 on the GSV and syntaxin4 and SNAP23 on the plasma membrane. This complex can then facilitate fusion of GSV with the plasma membrane. Devise an experiment that would allow to confirm this sequence of events. (8p)
[[Bestand:GLUT4_pathway.jpg|700px|thumb|center|GLUT4]]

=== 17 januari 2014 ===
# In je labo heb je een commerciÃ«le two-photon microscoop met een 1064 nm laser. Je onderzoekt extracellulaire collageenafzettingen in weefsel van muizen, collageen vertoont SHG. Je wil simultaan ook het cytoskelet en een cytoplasmatisch proteÃ¯ne visualiseren, hiervoor heb je de keuze uit enkele FP's, waarvan de absorbtie- en emissiespectra gegeven zijn.
#* Welke FP's wil je gebruiken en waarom?
#* Beschrijf de set-up die je gaat gebruiken (filters, spiegels, objective lens,...) en waarom.
#* Bereken de energie, in golfgetal, van de fotonen die je laser uitzendt.
# Onderzoek ATP synthase (zie Dynamische Biochemie I), een moleculaire motor die, aangedreven door ATP, protonen transporteert over het celmembraan. Het model van het mechanisme is dat de A-en B-subunits rond eiwit D draaien. Door de symetrie worden stappen van 120Â° gesuggereerd. (het gaat dus over: [http://www.youtube.com/watch?v=PjdPTY1wHdQ] )
#* Bedenk een experiment, gebruik makende van de technieken gezien in de cursus, dat deze hypothese kan bevestigen of verwerpen.

=== 21 januari 2013 ===
# Raman Scattering
#* 2 technieken geven voor het waarnemen van metal nanopartikels (DIC en darkfield)
#* SERS ( je moest adenine en thymine onderscheiden en kreeg hiervoor het ramanspectrum)
#**Bereken de signalen die je bij het spectrum van A en T zult krijgen bij een laser van 488 nm
#**Je kreeg een eenvoudige tekening van een microscoop waarop je dan alle golflengtes, filters en detectoren moest plaatsen en benoemen
#** Welke detector gebruik je hierbij?
# Membraanprocessen visualiseren
#*function (was een Ca2+ kanaal, FRET)
#*Colocolization (FCCS)
#*stoichiometrie (NALMS)
#*diffusion (SPT)
# protein folding
#* De bedoeling was een experiment te ontwerpen op basis van deze cursus waarbij men de dynamica van verkeerd gevouwen proteÃ¯ne kon nagaan maar ook van de juist gevouwen
# Laser Safety
#* welke bril moet je nemen uit de tabel
#* bereken hoeveel power het oog dan bereikt (uit de tabel kreeg je de OD van de bril en je kreeg ook de laser specificaties)
#* Hoeveel fotonen bereiken dan het oog?

=== 20 januari 2012 ===
# Raman scattering
#* Drie golfgetallen en de golflengte van de laser gegeven en dan moet je de golflengte bepalen voor de Stokes en anti-Stokes shift
# Single Particle Tracking
#* je moet een traject tekenen voor een nanopartikel opgenomen van 10 verschillende beelden
#* in detail uitleggen hoe je de analyse doet om er een model aan te correleren
#* de camera frame rate bepalen voor als er twee moleculen passeren waarvan Ã©Ã©n traag (1ÂµmÂ²/s) en Ã©Ã©n snel (10ÂµmÂ²/s)
# Sequencing
#* voor- en nadelen van eerste en tweede generatie vs single molecule
#* is het geschikt voor optical mapping?
#* als je een genoom zou kunnen sequeneren op een volledige dag voor 100â‚¬ zou je daar dan gebruik van maken en waarom?
# Bedenk een experiment om de interactie tussen nanopartikels (20-40 nm) en microtubuli (bij celdeling) te visualiseren (aangezien microtubuli rond 15nm zijn, resolutie microscopy: bv. PALM)
# Energietransfer
#* spectra gegeven van 3 verschillende kleurstoffen en daar de energie transfer van bespreken (FRET, energie hopping, andere buiten FÃ¶rster: Dexter (<1nm) en radiatief)

=== 21 januari 2011 ===

# Waarom mogen er niet te veel fotonen waargenomen worden per excitatiepuls bij Time-correlated single photon couting?
#* ANTW: Stel dat er per puls dat door het staal gaan een paar fotonen geÃ«miteerd worden, dan gaat ge telkens maar de eerste waarnemen (tot een stop leiden) en gaat uw uiteindelijke lifetime korter zijn dan werkelijk het geval is...
#
#* Iets met lasser glasses. Je krijgt gegeven dat je een 2P-experiment doet met een Nd:YAG laser en dan is de vraag welke bril je zou kiezen (4 mogelijkheden gegeven) (ANTW: je gaat na bij welke golflengte de laser werkt en je weet dat je met een hoge intensiteit werkt, dus de OD van de bril moet groot zijn en dan moet je ook een bril voor de geschikte golflengte gebruiken)
#* Vervolgens geven ze dat de laser een puls breedte heeft van 7,5ps, een output van 3W en een frequentie van een aantal MHz. De vraag was dan hoeveel fotonen je per puls krijgt) (ANTW: Ephoton=h*c/Î» (Î» weet je omdat je de laser kent) en dan moet ge uw output delen door uw frequentie om te weten welke output 1 puls heeft en die energie deel je dan door Ephoton)
# Ze labelen een spierproteÃ¯ne van C. elegans met mCherry (genetic labeling).
#* De eerste vraag was met welke microscoop detecteer je of het labelen gelukt is? (ANTW: widefield als je gwn wilt weten of het gelukt is, maar confocal om te zien of het wel in spieren zit)
#* Bedenk een techniek waarbij je geen labels gebruikt (ANTW: 2nd Harmonic generation)
#* Stel een schema op van de set-up waarbij je A en B combineert, zodat je beide simultaan kan meten (ANTW: hier willen ze zien of ge snapt hoe dichroÃ¯c mirror werkt enzo, da ge rekening houdt met de golflengtes en doorlaten en weerkaatsen enzo..)
#* Vervolgens geven ze dat je met raman een proteÃ¯ne waarneemt met een specifiek signaal op 1600cm-1. En ze willen nu weten waar ze het signaal van de laserbeam waarnemen bij SRS als je weet dat de stokes beam op 1064nm is. En geef dan ook waar je het CARS signaal zou waarnemen (ANTW: die 1600 is eigenlijk Î©vibr, en nu weet ge da Ï‰pump= Ï‰stokes+ Î©vibr, hoe dit met die frequenties dan exact in elkaar steekt weet ik nimeer, wnt ik had deze vraag ni juist en ze hebbe da dan zo snel proberen uit te leggenâ€¦ eens ge dan Ï‰pump weet, kunt ge het signaal voor CARS bepalen met 2Ï‰pump-Ï‰stokes)
#* Voordelen van CARS tov spontane Raman (ANTW: vrij letterlijk in cursus :p)
#* Teken weer een schema maar nu met het extra ding van raman
# Is een high NA nodig voor FCS? (ANTW: ja, omdat ge hierdoor beter kunt focussen in 1 vlak, het draagt bij tot een kleiner confocul volume, want minder grote hoogte (Z-as), of toch iets in die aardâ€¦)
# Bespreek met welke technieken je dynamica kan bestuderen en wat is het verschil tussen die technieken (ANTW: FCS, SPT en FRAP kort uitleggen, en het verschil is da ge bij FCS en FRAP een gemiddelde life-time gaat berekenen en bij SPT. Bij FCS kunt ge tov FRAP wel eventueel een onderscheid maken tussen populaties, dit is bij FRAP helemaal niet mogelijk)
#
#* Ge kreeg een figuurtje van een holiday junctie met fluoroforen en er was een evenwicht tussen 2 conformationele toestanden. Dan kwam ge te weten dat CY5 een acceptor is van CY3 en dat CY5.5 en acceptor is van CY5. Er gaat FRET optreden tussen deze fluoroforen en ge moest een schema geven van de Intensiteit tov de tijd met het gegeven da ge eerst 20s conformatie 1 had en dan 20s conformatie 2 om trg 20s conformatie 1 te hebben en dan treed er bleaching op van CY5.5 en na nog eens 10s treed er bleaching op van CY3, maar het moeilijke eraan was dat ge het volgende kreeg: de lifetime van CY3 is 5ns, die van CY5 is 4ns en die van CY5.5 is 7. In conformatie 1 zijn de lifetimes de volgende CY3:1ns, CY5 2ns en C5.5:7ns, in conformatie 2 verandert dan enkel de lifetime van CY3 en deze wordt 3ns. (ANTW: de bedoeling is da ge hier efficienties uitrekent (E=1-(Ï„DA/Ï„D) en zo dus relatieve intensiteiten gaat uitzetten, achteraf gezien wel een simpele oplossing, maar er zijn er maar weinig die dit haddenâ€¦)
#* Krijgt ge hetzelfe resultaat als je CY5 en CY5.5 vervangt door 2 DRONPAs? En krijg je hetzelfde resultaat als je beide vervangt door 2KAEDEs? (ANTW: Doordat je vervangt door 2 keer hetzelfde ga je uiteraard niet hetzelfde zien. DRONPA is photoswitchable en zo kan je FRET combineren met aan en uit zetten van DRONPA, KAEDE is photoconverteble en zo kan je FRET combineren met switchen tss 2 kleuren van KAEDE)
# Hoeveel labels moet een 2Âµm actinefilament bevatten opdat ge het met 10nm zou kunnen waarnemen? (ANTW: 2000nm/10nm=200 ïƒ je hebt minstens het dubbel hiervan nodig (400), wnt je wilt weten wat er zich tussen labels dat op 10nm van elkaar staan afspeelt, dus minstens om de 5nm een label zetten)

=== 1 september 2010 ===

[[Bestand:HIV_replication_cycle.gif|150px|thumb|right|HIV replication cycle]]
# (12 punten) Afbeelding HIV replicatieyclus gegeven. Bedenk experimenten gebaseerd op technieken die we in de cursus gezien hebben (en uiteindelijk ook biochemische technieken) om onderstaande onderzoeksvragen te behandelen. Hoe kan je:
#* docking van het virus visualiseren?
#* bewijzen dat docking al dan niet receptor-gemedieerd is?
#* aantonen of transport van het viraal DNA gebeurt door actief transport of door vrije diffusie?
#* bewijzen dat het viraal DNA door nucleaire poriÃ«n wordt getransporteerd?
#* bewijzen dat het viraal DNA geÃ¯ntegreerd is in het cellulaire DNA?
#* bewijzen dat er nieuwe virale eiwitten worden aangemaakt?
# (4 punten) Is de volgende bewering correct of niet?: "Voor het bestuderen van moleculaire interacties is FCS een betere techniek dan BiFC." Motiveer je antwoord.
# (4 punten) Hoe kan men het contrast in lichtmicroscopie verbeteren?

=== 18 januari 2010 ===

# Hoe kan je DNA sequencen met behulp van raman spectroscopie? Stel een experimentele setup voor.
# Waar moet je op letten bij fluorescentie in vivo? Wat zijn de problemen, hoe kan je die oplossen? Welke technieken zijn geschikt en wat zijn voordelen/nadelen?
# Geef manieren om contrast in optische microscopie te verhogen.
# Signaalpathway gegeven van een G-proteine en adenyl cyclase (in membraan). Hoe kan je de interactie tussen G-proteine en adenyl cyclase onderzoeken? Is dit systeem geschikt voor single molecule? Geef de single molecule time traces.
# Verschil tussen anti-stokes raman (direct meten) en CARS.
# Ontwerp een experiment om de toxiciteit van nanoparticles te onderzoeken. Vaak wordt gesuggereerd dat nanoparticles direct interfereren met de celcyclus. Hoe kan je dat onderzoeken?
# Vraagje over FRAP van membraanproteine. Berekenen van diffusiecoÃ«fficient. (500 nm diameter bleach spot + half recovery op x s gegeven).

=== 15 januari 2010 ===

# Voordelen van single molecule DNA sequencing? Verschil tussen methode met exonuclease en met polymerase? Methode voor single molecule DNA sequencing zonder fluorescentie? (4 ptn)
# Bestuderen van protein folding. Vaststellen van 'rare misfolding' en 'folding'? Kinetica van folding en misfolding? Probability van misfolding? Stel een experiment op met de geziene technieken.) (4 ptn)
# Is het mogelijk om de temperatuur te bepalen met Raman Spectroscopy? (2 ptn)
# Conformatieveranderingen van <1nm bestuderen (3 ptn)
# Technieken om single molecules te bestuderen zonder fluo (2 ptn)
# Bestuderen van de dynamica van actinefilamenten (3 ptn)
# Foto's van fluo-gekleurde cellen: multi-exposure view, intensiteit, lifetime image: wordt elk fluorofoor correct geÃ¯dentificeerd in legende? Hoe werd lifetime image gemaakt? (2 ptn)

=== 30 januari 2009 ===

# Gegeven een figuur van DNA-sequentie-methode. Een proefopstelling daarvoor tekenen, en karakteristieken van de dyes en de optische componenten geven.
# Wat is de PSF. Kan je die veranderen? Hoe?
# Vreemde vraag van halve bladzijde. Kwam er op neer dat ze het zelf nog niet zo goed wisten en dat een E. coli ongeveer de grootte van de focal spot heeft.
# Drie vraagjes van Visser. Bijna letterlijk.
# Nog drie vraagjes van Visser. Al bijna even letterlijk.
# Een polynucleotide (<20nt) is aan de ene kant gemerkt met een dye (MB121 of zo). Er zijn een paar mutaties gemaakt: er werd op bepaalde plaatsen G (dat in de "wt" afwezig was) ingebracht. Resultaat: lifetime vermindert, abs/em niet (rond de 600nm, G zit rond 300nm is gegeven). Wat gebeurt er en hoe kan je het kwantitatief bestuderen?

=== 26 januari 2009 ===

# Welke methode zou je gebruiken om chaperone gemedieerd folding proces te onderzoeken, bespreek kort de theoratische achtergrond. (FRET) Stel 2 mogelijke labelingsstrategieen voor. Kan dit ook bestudeerd worden via elektron transfer, hoe ziet een single molecule trace er dan uit en dergelijke.
# Hoe zou je de volgende processen bestuderen: Ca2+ release in cellen, diffusie in membraan, colocalisatie, stoichiometrie.
# Bespreek de uitspraak 'PALM en STED zijn volledig gebaseerd op hetzelfde principe'
# Hoe kan je achtergrond/autofluorescentie vermijden of bestrijden? Hoe verhoog je contrast in optische microscopie (wees volledig)
# Twee kleinere vraagjes over FRET-FRAP experiment met de androgen receptor
# Drie kleinere vraagjes rond FLIM

=== 18 januari 2008 ===

# (4punten) De eerste vraag ging over een RET waarbij drie fluorophoren in twee conformaties voorkomen en naargelang de conformatie was er tussen twee van de drie RET en dan moest je daar een diagram van tekenen: Fluorescentie intensiteit ifv de tijd. Als extra moest je dan ook nog eens een diagram tekenen als er RET was tussen alle drie. Bij deze vraag moest je telkens rekening houden met de efficientie van transfer.
# (3punten) Een schema dat je moest vervolledigen: je kreeg de technieken FCS, FRAP, FCCS en FRET-FLIM en dan moest je bij alle zeggen of je er dynamics mee kon bestuderen, of je naar moleculaire interacties kon kijken, de conc. range die nodig is voor de techniek en de tijdsschaal waarop gekeken wordt.
# (2punten) Als je met een microscoop met twee kanalen co-localizatie waarneemt, heb je dan interactie tussen beide moleculen?
# (2punten) We hadden in de les twee artikels behandeld van Sunexie (of zoiets)
#* Waarom wordt het proteine onder de lac promotor tot expressie gebracht?
#* Waarom veranker je YFP aan een membraanproteine?
# (3punten) Wat is de Point spread function (PSF) in microscopie. Kun je deze veranderen en zoja, hoe?
# (4punten) Hoe kun je autofluorescentie vermijden/overkomen vanuit het oogpunt van microscopie?
# (2punten) Je hebt een bepaalde dye die aan het 3' uiteinde van een oligonucleotide wordt gehangen. (dan had je een tabelletje met 4 oligonucleotiden en dan de levensduur van de dye) Als er zich een Guanine in de buurt van de dye komt, dan wordt de levensduur van de dye plots veel korter. Het absorptiemaximum van de dye ligt rond 650nm en het absorptieminimum rond 680. Nucleotiden absorberen enkel op golflengtes kleiner dan 330nm.
#* Van welk proces is hier sprake?
#* Welke quantitatieve informatie kun je hieruit afleiden?</text>

Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy

2022-01-28T15:27:36Z

R0837412: /* Examenvragen */

[[Categorie: Mabb]]
[[Categorie: Machemie]]

== Vakinformatie ==
Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy
Boeiend vak, gegeven door Johan Hofkens, Maarten Roeffaers, Elke Debroye en Jelle Hendrix.
Vak telt ook soort van (niet verplichte) practicumsessies, waarin je kort ingeleid wordt tot diverse microscopische/fluorescentie-technieken.
Mondeling examen dat open boek is, waarbij je alles (inclusief laptop met internet) mag gebruiken.

ECTS-fiche: https://onderwijsaanbod.kuleuven.be/syllabi/e/G0G59AE.htm

== Examenvragen ==

===Exam January 2022===
Exam was composed of two parts:
First part (Hofkens): Studies have seen that applying a functional substrate makes G-protein couple receptor dimerize and a quicker vesicle formation (recycling of G-protein coupled receptor). With a truncated version of the substrate, you get a slower vesicle formation, and no dimerisation.
Divided in two exercises:
#*1) (5 points) Describe how would you observe that the substrate produces dimerisation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers. (For example: FRET in combination with TIRF).
#*2) (5 points) How would you prove that there is downstream signal transduction, and you want to observe the process of vesicle formation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers.

Second part (Maarten) (6 points): Carbon nanotubes are claimed to be able to enter cancer cells and deliver a drug in cancer tissue. You doubt it, and you want to check if this is true.
What approach would you use? Motivate your answer. Will you be using tags? Justify why you do or do not use and motivate your answer. (For example: Raman microscopy with use of Raman tag Alkyne).

===Mededeling januari 2021===
Door een crash van de wiki zijn verschillende afbeeldingen en bestanden verloren gegaan. Wanneer je op een link klikt en er dus geen bestand opent, is dit spijtig genoeg niet meer beschikbaar op de wiki. Er is dus niks mis met jouw computer of inloggegevens.

Due to a crash of the wiki certain images and documents have been lost. When you try opening them with the link provided, they will not show anymore. There is nothing wrong with your computer or credentials. This is a general problem.
=== 14 januari 2019 NM ===
#Vraag van Hofkens: geef technieken om signaling via EGF-EGFR-Gbr2-Sos-Ras-Raf te bestuderen (vb FRET, STED, FCS) + geef technieken om uit te zoeken of EGFR nog een signaling platform is nadat het in een clathrin-coated vesicle is geïntegreerd (vb FRET). Veel meer uitleg werd gegeven in de opgave.
#Vraag Maarten: Photoactivatible GFP (spectrum gegeven): Kun je dit gebruiken bij:
#*A) Confocal
#*B) PALM
#*C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging. (antwoord: confocal gaat maar niet zo nuttig; ja voor PALM + teken met alle lenzen, dichroic, camera; niet voor STED/RESOLFT want kan je niet terug uitschakelen)

=== 19 januari 2018===
#
#* Er is een excitatie- en emissiespectrum van verschillende FPs gegeven en je hebt een microscoop met lasers 488, 600zoveel en 1050nm. Welke fluorofoor zou je gebruiken om te meten in C. elegans?
#* Je wilt de interactie tussen eiwit A, gelabeld met je antwoord uit 1.1, en eiwit B meten. Hoe zou je dat doen? Welk fluorofoor zou je hiervoor gebruiken?
#* Kun je tegelijkerwijd ook SHG doen? Zo ja, hoe?
#* Teken de opstelling, leg de onderdelen uit en geef specifiek een detail over het objectief.
#
#* Photoactivatible GFP: Kun je dit gebruiken bij A) Confocal B) PALM C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging
#* Bereken een golfgetal om in een golflengte

=== 18 januari 2016 ===
Hetzelfde examen als 17 januari 2014

=== 15 januari 2016===
Vraag 1: Raman:
#bereken de stokes en anti-stokes van de verschillende fluorescent proteins.
#Welk van de volgende fluorescent proteins kan je gebruiken om TEGELIJK fluorescentie en Raman te bekijken. (Raman is net om geen labelling te moeten doen! Je moet dus werken via anti-stokes en dsRED om tegelijk fluorescentie en Raman te kunnen meten)
#Welke detector en filters zou je gebruiken?

[[Media:Fpintrofigure3.jpg]]

Vraag 2:

Verklaar het volgend mechanisme adhv verschillende technieken gezien in de cursus:
Helicase van hepatitis C bestaat uit 3 delen (groen, blauw en geel). Groen en blauw breken de DNA strand 3 nucleotiden, dan is de spanning tussen gele deel en groen+blauw hoog zodat geel verspring tot aan groene en blauwe deel. Dit start opnieuw. De reactie gebruikt hiervoor ATP.

===21 januari 2014===
#Below you can find the spectral properties of photoactivatable-GFP, a green fluorescent protein that has a dark state (purple absorbance) and a fluorescent state (cyan absorbance and green emission).
Is it possible to use this fluorescent protein for in 1) confocal (2p), 2) PALM (2p) or 3) STED microscopy (2p)? If yes, draw and explain the experimental setup (light source, optics and detectors) and highlight the associated strengths and weaknesses of this type of microscopy to study biological specimens.
You have a laser available in the lab that generates photons with an energy of 20494 cm-1, convert this to a wavelength in nanometres. (2p)[[Bestand:PA-GFP.jpg|418px|thumb|center|PA-GFP]]
#Glut4 is one of the sugar transporter proteins in humans and responsible for the tight regulation of blood glucose concentration. The cartoon below represents part of the complex trafficking pathway of GLUT4, namely an overview of the steps involved in GLUT4 trafficking at the plasma membrane. GSV's interact with a host molecules as they are delivered to the cell periphery and thethered, docked and fused at the plasma membrane. GSV's approach the plasma membrane were they are tethered by actin, the exocyst or TBC1D4, or a combination of these in parallel or in series. The vesicle docks with the plasma membrane as the ternary complex is formed between VAMP2 on the GSV and syntaxin4 and SNAP23 on the plasma membrane. This complex can then facilitate fusion of GSV with the plasma membrane. Devise an experiment that would allow to confirm this sequence of events. (8p)
[[Bestand:GLUT4_pathway.jpg|700px|thumb|center|GLUT4]]

=== 17 januari 2014 ===
# In je labo heb je een commerciÃ«le two-photon microscoop met een 1064 nm laser. Je onderzoekt extracellulaire collageenafzettingen in weefsel van muizen, collageen vertoont SHG. Je wil simultaan ook het cytoskelet en een cytoplasmatisch proteÃ¯ne visualiseren, hiervoor heb je de keuze uit enkele FP's, waarvan de absorbtie- en emissiespectra gegeven zijn.
#* Welke FP's wil je gebruiken en waarom?
#* Beschrijf de set-up die je gaat gebruiken (filters, spiegels, objective lens,...) en waarom.
#* Bereken de energie, in golfgetal, van de fotonen die je laser uitzendt.
# Onderzoek ATP synthase (zie Dynamische Biochemie I), een moleculaire motor die, aangedreven door ATP, protonen transporteert over het celmembraan. Het model van het mechanisme is dat de A-en B-subunits rond eiwit D draaien. Door de symetrie worden stappen van 120Â° gesuggereerd. (het gaat dus over: [http://www.youtube.com/watch?v=PjdPTY1wHdQ] )
#* Bedenk een experiment, gebruik makende van de technieken gezien in de cursus, dat deze hypothese kan bevestigen of verwerpen.

=== 21 januari 2013 ===
# Raman Scattering
#* 2 technieken geven voor het waarnemen van metal nanopartikels (DIC en darkfield)
#* SERS ( je moest adenine en thymine onderscheiden en kreeg hiervoor het ramanspectrum)
#**Bereken de signalen die je bij het spectrum van A en T zult krijgen bij een laser van 488 nm
#**Je kreeg een eenvoudige tekening van een microscoop waarop je dan alle golflengtes, filters en detectoren moest plaatsen en benoemen
#** Welke detector gebruik je hierbij?
# Membraanprocessen visualiseren
#*function (was een Ca2+ kanaal, FRET)
#*Colocolization (FCCS)
#*stoichiometrie (NALMS)
#*diffusion (SPT)
# protein folding
#* De bedoeling was een experiment te ontwerpen op basis van deze cursus waarbij men de dynamica van verkeerd gevouwen proteÃ¯ne kon nagaan maar ook van de juist gevouwen
# Laser Safety
#* welke bril moet je nemen uit de tabel
#* bereken hoeveel power het oog dan bereikt (uit de tabel kreeg je de OD van de bril en je kreeg ook de laser specificaties)
#* Hoeveel fotonen bereiken dan het oog?

=== 20 januari 2012 ===
# Raman scattering
#* Drie golfgetallen en de golflengte van de laser gegeven en dan moet je de golflengte bepalen voor de Stokes en anti-Stokes shift
# Single Particle Tracking
#* je moet een traject tekenen voor een nanopartikel opgenomen van 10 verschillende beelden
#* in detail uitleggen hoe je de analyse doet om er een model aan te correleren
#* de camera frame rate bepalen voor als er twee moleculen passeren waarvan Ã©Ã©n traag (1ÂµmÂ²/s) en Ã©Ã©n snel (10ÂµmÂ²/s)
# Sequencing
#* voor- en nadelen van eerste en tweede generatie vs single molecule
#* is het geschikt voor optical mapping?
#* als je een genoom zou kunnen sequeneren op een volledige dag voor 100â‚¬ zou je daar dan gebruik van maken en waarom?
# Bedenk een experiment om de interactie tussen nanopartikels (20-40 nm) en microtubuli (bij celdeling) te visualiseren (aangezien microtubuli rond 15nm zijn, resolutie microscopy: bv. PALM)
# Energietransfer
#* spectra gegeven van 3 verschillende kleurstoffen en daar de energie transfer van bespreken (FRET, energie hopping, andere buiten FÃ¶rster: Dexter (<1nm) en radiatief)

=== 21 januari 2011 ===

# Waarom mogen er niet te veel fotonen waargenomen worden per excitatiepuls bij Time-correlated single photon couting?
#* ANTW: Stel dat er per puls dat door het staal gaan een paar fotonen geÃ«miteerd worden, dan gaat ge telkens maar de eerste waarnemen (tot een stop leiden) en gaat uw uiteindelijke lifetime korter zijn dan werkelijk het geval is...
#
#* Iets met lasser glasses. Je krijgt gegeven dat je een 2P-experiment doet met een Nd:YAG laser en dan is de vraag welke bril je zou kiezen (4 mogelijkheden gegeven) (ANTW: je gaat na bij welke golflengte de laser werkt en je weet dat je met een hoge intensiteit werkt, dus de OD van de bril moet groot zijn en dan moet je ook een bril voor de geschikte golflengte gebruiken)
#* Vervolgens geven ze dat de laser een puls breedte heeft van 7,5ps, een output van 3W en een frequentie van een aantal MHz. De vraag was dan hoeveel fotonen je per puls krijgt) (ANTW: Ephoton=h*c/Î» (Î» weet je omdat je de laser kent) en dan moet ge uw output delen door uw frequentie om te weten welke output 1 puls heeft en die energie deel je dan door Ephoton)
# Ze labelen een spierproteÃ¯ne van C. elegans met mCherry (genetic labeling).
#* De eerste vraag was met welke microscoop detecteer je of het labelen gelukt is? (ANTW: widefield als je gwn wilt weten of het gelukt is, maar confocal om te zien of het wel in spieren zit)
#* Bedenk een techniek waarbij je geen labels gebruikt (ANTW: 2nd Harmonic generation)
#* Stel een schema op van de set-up waarbij je A en B combineert, zodat je beide simultaan kan meten (ANTW: hier willen ze zien of ge snapt hoe dichroÃ¯c mirror werkt enzo, da ge rekening houdt met de golflengtes en doorlaten en weerkaatsen enzo..)
#* Vervolgens geven ze dat je met raman een proteÃ¯ne waarneemt met een specifiek signaal op 1600cm-1. En ze willen nu weten waar ze het signaal van de laserbeam waarnemen bij SRS als je weet dat de stokes beam op 1064nm is. En geef dan ook waar je het CARS signaal zou waarnemen (ANTW: die 1600 is eigenlijk Î©vibr, en nu weet ge da Ï‰pump= Ï‰stokes+ Î©vibr, hoe dit met die frequenties dan exact in elkaar steekt weet ik nimeer, wnt ik had deze vraag ni juist en ze hebbe da dan zo snel proberen uit te leggenâ€¦ eens ge dan Ï‰pump weet, kunt ge het signaal voor CARS bepalen met 2Ï‰pump-Ï‰stokes)
#* Voordelen van CARS tov spontane Raman (ANTW: vrij letterlijk in cursus :p)
#* Teken weer een schema maar nu met het extra ding van raman
# Is een high NA nodig voor FCS? (ANTW: ja, omdat ge hierdoor beter kunt focussen in 1 vlak, het draagt bij tot een kleiner confocul volume, want minder grote hoogte (Z-as), of toch iets in die aardâ€¦)
# Bespreek met welke technieken je dynamica kan bestuderen en wat is het verschil tussen die technieken (ANTW: FCS, SPT en FRAP kort uitleggen, en het verschil is da ge bij FCS en FRAP een gemiddelde life-time gaat berekenen en bij SPT. Bij FCS kunt ge tov FRAP wel eventueel een onderscheid maken tussen populaties, dit is bij FRAP helemaal niet mogelijk)
#
#* Ge kreeg een figuurtje van een holiday junctie met fluoroforen en er was een evenwicht tussen 2 conformationele toestanden. Dan kwam ge te weten dat CY5 een acceptor is van CY3 en dat CY5.5 en acceptor is van CY5. Er gaat FRET optreden tussen deze fluoroforen en ge moest een schema geven van de Intensiteit tov de tijd met het gegeven da ge eerst 20s conformatie 1 had en dan 20s conformatie 2 om trg 20s conformatie 1 te hebben en dan treed er bleaching op van CY5.5 en na nog eens 10s treed er bleaching op van CY3, maar het moeilijke eraan was dat ge het volgende kreeg: de lifetime van CY3 is 5ns, die van CY5 is 4ns en die van CY5.5 is 7. In conformatie 1 zijn de lifetimes de volgende CY3:1ns, CY5 2ns en C5.5:7ns, in conformatie 2 verandert dan enkel de lifetime van CY3 en deze wordt 3ns. (ANTW: de bedoeling is da ge hier efficienties uitrekent (E=1-(Ï„DA/Ï„D) en zo dus relatieve intensiteiten gaat uitzetten, achteraf gezien wel een simpele oplossing, maar er zijn er maar weinig die dit haddenâ€¦)
#* Krijgt ge hetzelfe resultaat als je CY5 en CY5.5 vervangt door 2 DRONPAs? En krijg je hetzelfde resultaat als je beide vervangt door 2KAEDEs? (ANTW: Doordat je vervangt door 2 keer hetzelfde ga je uiteraard niet hetzelfde zien. DRONPA is photoswitchable en zo kan je FRET combineren met aan en uit zetten van DRONPA, KAEDE is photoconverteble en zo kan je FRET combineren met switchen tss 2 kleuren van KAEDE)
# Hoeveel labels moet een 2Âµm actinefilament bevatten opdat ge het met 10nm zou kunnen waarnemen? (ANTW: 2000nm/10nm=200 ïƒ je hebt minstens het dubbel hiervan nodig (400), wnt je wilt weten wat er zich tussen labels dat op 10nm van elkaar staan afspeelt, dus minstens om de 5nm een label zetten)

=== 1 september 2010 ===

[[Bestand:HIV_replication_cycle.gif|150px|thumb|right|HIV replication cycle]]
# (12 punten) Afbeelding HIV replicatieyclus gegeven. Bedenk experimenten gebaseerd op technieken die we in de cursus gezien hebben (en uiteindelijk ook biochemische technieken) om onderstaande onderzoeksvragen te behandelen. Hoe kan je:
#* docking van het virus visualiseren?
#* bewijzen dat docking al dan niet receptor-gemedieerd is?
#* aantonen of transport van het viraal DNA gebeurt door actief transport of door vrije diffusie?
#* bewijzen dat het viraal DNA door nucleaire poriÃ«n wordt getransporteerd?
#* bewijzen dat het viraal DNA geÃ¯ntegreerd is in het cellulaire DNA?
#* bewijzen dat er nieuwe virale eiwitten worden aangemaakt?
# (4 punten) Is de volgende bewering correct of niet?: "Voor het bestuderen van moleculaire interacties is FCS een betere techniek dan BiFC." Motiveer je antwoord.
# (4 punten) Hoe kan men het contrast in lichtmicroscopie verbeteren?

=== 18 januari 2010 ===

# Hoe kan je DNA sequencen met behulp van raman spectroscopie? Stel een experimentele setup voor.
# Waar moet je op letten bij fluorescentie in vivo? Wat zijn de problemen, hoe kan je die oplossen? Welke technieken zijn geschikt en wat zijn voordelen/nadelen?
# Geef manieren om contrast in optische microscopie te verhogen.
# Signaalpathway gegeven van een G-proteine en adenyl cyclase (in membraan). Hoe kan je de interactie tussen G-proteine en adenyl cyclase onderzoeken? Is dit systeem geschikt voor single molecule? Geef de single molecule time traces.
# Verschil tussen anti-stokes raman (direct meten) en CARS.
# Ontwerp een experiment om de toxiciteit van nanoparticles te onderzoeken. Vaak wordt gesuggereerd dat nanoparticles direct interfereren met de celcyclus. Hoe kan je dat onderzoeken?
# Vraagje over FRAP van membraanproteine. Berekenen van diffusiecoÃ«fficient. (500 nm diameter bleach spot + half recovery op x s gegeven).

=== 15 januari 2010 ===

# Voordelen van single molecule DNA sequencing? Verschil tussen methode met exonuclease en met polymerase? Methode voor single molecule DNA sequencing zonder fluorescentie? (4 ptn)
# Bestuderen van protein folding. Vaststellen van 'rare misfolding' en 'folding'? Kinetica van folding en misfolding? Probability van misfolding? Stel een experiment op met de geziene technieken.) (4 ptn)
# Is het mogelijk om de temperatuur te bepalen met Raman Spectroscopy? (2 ptn)
# Conformatieveranderingen van <1nm bestuderen (3 ptn)
# Technieken om single molecules te bestuderen zonder fluo (2 ptn)
# Bestuderen van de dynamica van actinefilamenten (3 ptn)
# Foto's van fluo-gekleurde cellen: multi-exposure view, intensiteit, lifetime image: wordt elk fluorofoor correct geÃ¯dentificeerd in legende? Hoe werd lifetime image gemaakt? (2 ptn)

=== 30 januari 2009 ===

# Gegeven een figuur van DNA-sequentie-methode. Een proefopstelling daarvoor tekenen, en karakteristieken van de dyes en de optische componenten geven.
# Wat is de PSF. Kan je die veranderen? Hoe?
# Vreemde vraag van halve bladzijde. Kwam er op neer dat ze het zelf nog niet zo goed wisten en dat een E. coli ongeveer de grootte van de focal spot heeft.
# Drie vraagjes van Visser. Bijna letterlijk.
# Nog drie vraagjes van Visser. Al bijna even letterlijk.
# Een polynucleotide (<20nt) is aan de ene kant gemerkt met een dye (MB121 of zo). Er zijn een paar mutaties gemaakt: er werd op bepaalde plaatsen G (dat in de "wt" afwezig was) ingebracht. Resultaat: lifetime vermindert, abs/em niet (rond de 600nm, G zit rond 300nm is gegeven). Wat gebeurt er en hoe kan je het kwantitatief bestuderen?

=== 26 januari 2009 ===

# Welke methode zou je gebruiken om chaperone gemedieerd folding proces te onderzoeken, bespreek kort de theoratische achtergrond. (FRET) Stel 2 mogelijke labelingsstrategieen voor. Kan dit ook bestudeerd worden via elektron transfer, hoe ziet een single molecule trace er dan uit en dergelijke.
# Hoe zou je de volgende processen bestuderen: Ca2+ release in cellen, diffusie in membraan, colocalisatie, stoichiometrie.
# Bespreek de uitspraak 'PALM en STED zijn volledig gebaseerd op hetzelfde principe'
# Hoe kan je achtergrond/autofluorescentie vermijden of bestrijden? Hoe verhoog je contrast in optische microscopie (wees volledig)
# Twee kleinere vraagjes over FRET-FRAP experiment met de androgen receptor
# Drie kleinere vraagjes rond FLIM

=== 18 januari 2008 ===

# (4punten) De eerste vraag ging over een RET waarbij drie fluorophoren in twee conformaties voorkomen en naargelang de conformatie was er tussen twee van de drie RET en dan moest je daar een diagram van tekenen: Fluorescentie intensiteit ifv de tijd. Als extra moest je dan ook nog eens een diagram tekenen als er RET was tussen alle drie. Bij deze vraag moest je telkens rekening houden met de efficientie van transfer.
# (3punten) Een schema dat je moest vervolledigen: je kreeg de technieken FCS, FRAP, FCCS en FRET-FLIM en dan moest je bij alle zeggen of je er dynamics mee kon bestuderen, of je naar moleculaire interacties kon kijken, de conc. range die nodig is voor de techniek en de tijdsschaal waarop gekeken wordt.
# (2punten) Als je met een microscoop met twee kanalen co-localizatie waarneemt, heb je dan interactie tussen beide moleculen?
# (2punten) We hadden in de les twee artikels behandeld van Sunexie (of zoiets)
#* Waarom wordt het proteine onder de lac promotor tot expressie gebracht?
#* Waarom veranker je YFP aan een membraanproteine?
# (3punten) Wat is de Point spread function (PSF) in microscopie. Kun je deze veranderen en zoja, hoe?
# (4punten) Hoe kun je autofluorescentie vermijden/overkomen vanuit het oogpunt van microscopie?
# (2punten) Je hebt een bepaalde dye die aan het 3' uiteinde van een oligonucleotide wordt gehangen. (dan had je een tabelletje met 4 oligonucleotiden en dan de levensduur van de dye) Als er zich een Guanine in de buurt van de dye komt, dan wordt de levensduur van de dye plots veel korter. Het absorptiemaximum van de dye ligt rond 650nm en het absorptieminimum rond 680. Nucleotiden absorberen enkel op golflengtes kleiner dan 330nm.
#* Van welk proces is hier sprake?
#* Welke quantitatieve informatie kun je hieruit afleiden?</text>