Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy

Vakinformatie

Advanced Fluorescence and Fluorescence Microscopy Boeiend vak, gegeven door Johan Hofkens, Maarten Roeffaers, Elke Debroye en Jelle Hendrix. Vak telt ook soort van (niet verplichte) practicumsessies, waarin je kort ingeleid wordt tot diverse microscopische/fluorescentie-technieken. Mondeling examen dat open boek is, waarbij je alles (inclusief laptop met internet) mag gebruiken.

ECTS-fiche: https://onderwijsaanbod.kuleuven.be/syllabi/e/G0G59AE.htm

Examenvragen

Exam 25 January 2025

Hofkens (question is based on following paper: https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.10.09.561472v2.full)

Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are widley used in oncology and immunotherapy, targeting cell surface receptors to induce cytotoxicity responses. Advanced microscopy techniques are critical for understanding the molecular interactions underlying these processes.

1. Design an optical microscopy-based experiment to study how mAbs interact with a specific cell surface receptor (e.g. clustering, cross-linking, or receptor redistribution). In your answer: Identify the micrscopy technique(s) you would use and justify your choice(s). Explain the labeling strategy for both the mAbs and the receptor of interest, considering resolution, specificity, and live-cell imaging requirements. Describe the controls you would include to ensure reliable interpretation of your data.
2. Imagine that your chosen microscopy method reveals receptor clustering on microvili-like cellular protrusions following mAb RTX binding (as can be seen in the paper at Figure 4A). Propose a hypothesis for how this clustering might influence immune cell recruitment or receptor signaling, and outline an experimental plan to test your hypothesis.

Roeffaers

1. Photoactivatible GFP: Can you use this with A) Confocal B) PALM C) STED, if yes, draw the setup, explain the advantages and disadvantages of this technique for imaging biological samples.(draw the setup, including the laser that activates the PA-GFP! Roeffaers only looks at your drawings so make sure they are good and complete)
2. Bereken een golfgetal om in een golflengte

Exam 28 January 2022

Exam was composed of two parts:

First part (Hofkens): Studies have seen that applying a functional substrate makes G-protein couple receptor dimerize and a quicker vesicle formation (recycling of G-protein coupled receptor). With a truncated version of the substrate, you get a slower vesicle formation, and no dimerisation.

Divided in two exercises:

1. (5 points) Describe how would you observe that the substrate produces dimerisation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers. (For example: FRET in combination with TIRF).
2. (5 points) How would you prove that there is downstream signal transduction, and you want to observe the process of vesicle formation. Which technique would you use, fluorophore, setup. Motivate your answers.

Second part (Maarten) (6 points): Carbon nanotubes are claimed to be able to enter cancer cells and deliver a drug in cancer tissue. You doubt it, and you want to check if this is true. What approach would you use? Motivate your answer. Will you be using tags? Justify why you do or do not use and motivate your answer. (For example: Raman microscopy with use of Raman tag Alkyne).

Mededeling januari 2021

Door een crash van de wiki zijn verschillende afbeeldingen en bestanden verloren gegaan. Wanneer je op een link klikt en er dus geen bestand opent, is dit spijtig genoeg niet meer beschikbaar op de wiki. Er is dus niks mis met jouw computer of inloggegevens.

Due to a crash of the wiki certain images and documents have been lost. When you try opening them with the link provided, they will not show anymore. There is nothing wrong with your computer or credentials. This is a general problem.

14 januari 2019 NM

1. Vraag van Hofkens: geef technieken om signaling via EGF-EGFR-Gbr2-Sos-Ras-Raf te bestuderen (vb FRET, STED, FCS) + geef technieken om uit te zoeken of EGFR nog een signaling platform is nadat het in een clathrin-coated vesicle is geïntegreerd (vb FRET). Veel meer uitleg werd gegeven in de opgave.
2. Vraag Maarten: Photoactivatible GFP (spectrum gegeven): Kun je dit gebruiken bij:
   • A) Confocal
   • B) PALM
   • C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging. (antwoord: confocal gaat maar niet zo nuttig; ja voor PALM + teken met alle lenzen, dichroic, camera; niet voor STED/RESOLFT want kan je niet terug uitschakelen)

19 januari 2018

1. • Er is een excitatie- en emissiespectrum van verschillende FPs gegeven en je hebt een microscoop met lasers 488, 600zoveel en 1050nm. Welke fluorofoor zou je gebruiken om te meten in C. elegans?
   • Je wilt de interactie tussen eiwit A, gelabeld met je antwoord uit 1.1, en eiwit B meten. Hoe zou je dat doen? Welk fluorofoor zou je hiervoor gebruiken?
   • Kun je tegelijkerwijd ook SHG doen? Zo ja, hoe?
   • Teken de opstelling, leg de onderdelen uit en geef specifiek een detail over het objectief.
2. • Photoactivatible GFP: Kun je dit gebruiken bij A) Confocal B) PALM C) STED, zo ja, teken de opstelling, leg uit en beschrijf de voor en nadelen van deze techniek voor bio-imaging
   • Bereken een golfgetal om in een golflengte

18 januari 2016

Hetzelfde examen als 17 januari 2014

15 januari 2016

Vraag 1: Raman:

1. bereken de stokes en anti-stokes van de verschillende fluorescent proteins.
2. Welk van de volgende fluorescent proteins kan je gebruiken om TEGELIJK fluorescentie en Raman te bekijken. (Raman is net om geen labelling te moeten doen! Je moet dus werken via anti-stokes en dsRED om tegelijk fluorescentie en Raman te kunnen meten)
3. Welke detector en filters zou je gebruiken?

Vraag 2:

Verklaar het volgend mechanisme adhv verschillende technieken gezien in de cursus: Helicase van hepatitis C bestaat uit 3 delen (groen, blauw en geel). Groen en blauw breken de DNA strand 3 nucleotiden, dan is de spanning tussen gele deel en groen+blauw hoog zodat geel verspring tot aan groene en blauwe deel. Dit start opnieuw. De reactie gebruikt hiervoor ATP.

21 januari 2014

1. Below you can find the spectral properties of photoactivatable-GFP, a green fluorescent protein that has a dark state (purple absorbance) and a fluorescent state (cyan absorbance and green emission).

Is it possible to use this fluorescent protein for in 1) confocal (2p), 2) PALM (2p) or 3) STED microscopy (2p)? If yes, draw and explain the experimental setup (light source, optics and detectors) and highlight the associated strengths and weaknesses of this type of microscopy to study biological specimens.

You have a laser available in the lab that generates photons with an energy of 20494 cm^-1, convert this to a wavelength in nanometres. (2p)

Bestand:PA-GFP.jpg

PA-GFP

1. Glut4 is one of the sugar transporter proteins in humans and responsible for the tight regulation of blood glucose concentration. The cartoon below represents part of the complex trafficking pathway of GLUT4, namely an overview of the steps involved in GLUT4 trafficking at the plasma membrane. GSV's interact with a host molecules as they are delivered to the cell periphery and thethered, docked and fused at the plasma membrane. GSV's approach the plasma membrane were they are tethered by actin, the exocyst or TBC1D4, or a combination of these in parallel or in series. The vesicle docks with the plasma membrane as the ternary complex is formed between VAMP2 on the GSV and syntaxin4 and SNAP23 on the plasma membrane. This complex can then facilitate fusion of GSV with the plasma membrane. Devise an experiment that would allow to confirm this sequence of events. (8p)

Bestand:GLUT4 pathway.jpg

GLUT4

17 januari 2014

1. In je labo heb je een commerciële two-photon microscoop met een 1064 nm laser. Je onderzoekt extracellulaire collageenafzettingen in weefsel van muizen, collageen vertoont SHG. Je wil simultaan ook het cytoskelet en een cytoplasmatisch proteïne visualiseren, hiervoor heb je de keuze uit enkele FP's, waarvan de absorbtie- en emissiespectra gegeven zijn.
   • Welke FP's wil je gebruiken en waarom?
   • Beschrijf de set-up die je gaat gebruiken (filters, spiegels, objective lens,...) en waarom.
   • Bereken de energie, in golfgetal, van de fotonen die je laser uitzendt.
2. Onderzoek ATP synthase (zie Dynamische Biochemie I), een moleculaire motor die, aangedreven door ATP, protonen transporteert over het celmembraan. Het model van het mechanisme is dat de A-en B-subunits rond eiwit D draaien. Door de symetrie worden stappen van 120° gesuggereerd. (het gaat dus over: [1] )
   • Bedenk een experiment, gebruik makende van de technieken gezien in de cursus, dat deze hypothese kan bevestigen of verwerpen.

21 januari 2013

1. Raman Scattering
   • 2 technieken geven voor het waarnemen van metal nanopartikels (DIC en darkfield)
   • SERS ( je moest adenine en thymine onderscheiden en kreeg hiervoor het ramanspectrum)
     • Bereken de signalen die je bij het spectrum van A en T zult krijgen bij een laser van 488 nm
     • Je kreeg een eenvoudige tekening van een microscoop waarop je dan alle golflengtes, filters en detectoren moest plaatsen en benoemen
     • Welke detector gebruik je hierbij?
2. Membraanprocessen visualiseren
   • function (was een Ca²⁺ kanaal, FRET)
   • Colocolization (FCCS)
   • stoichiometrie (NALMS)
   • diffusion (SPT)
3. protein folding
   • De bedoeling was een experiment te ontwerpen op basis van deze cursus waarbij men de dynamica van verkeerd gevouwen proteïne kon nagaan maar ook van de juist gevouwen
4. Laser Safety
   • welke bril moet je nemen uit de tabel
   • bereken hoeveel power het oog dan bereikt (uit de tabel kreeg je de OD van de bril en je kreeg ook de laser specificaties)
   • Hoeveel fotonen bereiken dan het oog?

20 januari 2012

1. Raman scattering
   • Drie golfgetallen en de golflengte van de laser gegeven en dan moet je de golflengte bepalen voor de Stokes en anti-Stokes shift
2. Single Particle Tracking
   • je moet een traject tekenen voor een nanopartikel opgenomen van 10 verschillende beelden
   • in detail uitleggen hoe je de analyse doet om er een model aan te correleren
   • de camera frame rate bepalen voor als er twee moleculen passeren waarvan één traag (1µm²/s) en één snel (10µm²/s)
3. Sequencing
   • voor- en nadelen van eerste en tweede generatie vs single molecule
   • is het geschikt voor optical mapping?
   • als je een genoom zou kunnen sequeneren op een volledige dag voor 100€ zou je daar dan gebruik van maken en waarom?
4. Bedenk een experiment om de interactie tussen nanopartikels (20-40 nm) en microtubuli (bij celdeling) te visualiseren (aangezien microtubuli rond 15nm zijn, resolutie microscopy: bv. PALM)
5. Energietransfer
   • spectra gegeven van 3 verschillende kleurstoffen en daar de energie transfer van bespreken (FRET, energie hopping, andere buiten Förster: Dexter (<1nm) en radiatief)

21 januari 2011

1. Waarom mogen er niet te veel fotonen waargenomen worden per excitatiepuls bij Time-correlated single photon couting?
   • ANTW: Stel dat er per puls dat door het staal gaan een paar fotonen geëmiteerd worden, dan gaat ge telkens maar de eerste waarnemen (tot een stop leiden) en gaat uw uiteindelijke lifetime korter zijn dan werkelijk het geval is...
2. • Iets met lasser glasses. Je krijgt gegeven dat je een 2P-experiment doet met een Nd:YAG laser en dan is de vraag welke bril je zou kiezen (4 mogelijkheden gegeven) (ANTW: je gaat na bij welke golflengte de laser werkt en je weet dat je met een hoge intensiteit werkt, dus de OD van de bril moet groot zijn en dan moet je ook een bril voor de geschikte golflengte gebruiken)
   • Vervolgens geven ze dat de laser een puls breedte heeft van 7,5ps, een output van 3W en een frequentie van een aantal MHz. De vraag was dan hoeveel fotonen je per puls krijgt) (ANTW: Ephoton=h*c/λ (λ weet je omdat je de laser kent) en dan moet ge uw output delen door uw frequentie om te weten welke output 1 puls heeft en die energie deel je dan door Ephoton)
3. Ze labelen een spierproteïne van C. elegans met mCherry (genetic labeling).
   • De eerste vraag was met welke microscoop detecteer je of het labelen gelukt is? (ANTW: widefield als je gwn wilt weten of het gelukt is, maar confocal om te zien of het wel in spieren zit)
   • Bedenk een techniek waarbij je geen labels gebruikt (ANTW: 2nd Harmonic generation)
   • Stel een schema op van de set-up waarbij je A en B combineert, zodat je beide simultaan kan meten (ANTW: hier willen ze zien of ge snapt hoe dichroïc mirror werkt enzo, da ge rekening houdt met de golflengtes en doorlaten en weerkaatsen enzo..)
   • Vervolgens geven ze dat je met raman een proteïne waarneemt met een specifiek signaal op 1600cm-1. En ze willen nu weten waar ze het signaal van de laserbeam waarnemen bij SRS als je weet dat de stokes beam op 1064nm is. En geef dan ook waar je het CARS signaal zou waarnemen (ANTW: die 1600 is eigenlijk Ωvibr, en nu weet ge da ωpump= ωstokes+ Ωvibr, hoe dit met die frequenties dan exact in elkaar steekt weet ik nimeer, wnt ik had deze vraag ni juist en ze hebbe da dan zo snel proberen uit te leggen… eens ge dan ωpump weet, kunt ge het signaal voor CARS bepalen met 2ωpump-ωstokes)
   • Voordelen van CARS tov spontane Raman (ANTW: vrij letterlijk in cursus :p)
   • Teken weer een schema maar nu met het extra ding van raman
4. Is een high NA nodig voor FCS? (ANTW: ja, omdat ge hierdoor beter kunt focussen in 1 vlak, het draagt bij tot een kleiner confocul volume, want minder grote hoogte (Z-as), of toch iets in die aard…)
5. Bespreek met welke technieken je dynamica kan bestuderen en wat is het verschil tussen die technieken (ANTW: FCS, SPT en FRAP kort uitleggen, en het verschil is da ge bij FCS en FRAP een gemiddelde life-time gaat berekenen en bij SPT. Bij FCS kunt ge tov FRAP wel eventueel een onderscheid maken tussen populaties, dit is bij FRAP helemaal niet mogelijk)
6. • Ge kreeg een figuurtje van een holiday junctie met fluoroforen en er was een evenwicht tussen 2 conformationele toestanden. Dan kwam ge te weten dat CY5 een acceptor is van CY3 en dat CY5.5 en acceptor is van CY5. Er gaat FRET optreden tussen deze fluoroforen en ge moest een schema geven van de Intensiteit tov de tijd met het gegeven da ge eerst 20s conformatie 1 had en dan 20s conformatie 2 om trg 20s conformatie 1 te hebben en dan treed er bleaching op van CY5.5 en na nog eens 10s treed er bleaching op van CY3, maar het moeilijke eraan was dat ge het volgende kreeg: de lifetime van CY3 is 5ns, die van CY5 is 4ns en die van CY5.5 is 7. In conformatie 1 zijn de lifetimes de volgende CY3:1ns, CY5 2ns en C5.5:7ns, in conformatie 2 verandert dan enkel de lifetime van CY3 en deze wordt 3ns. (ANTW: de bedoeling is da ge hier efficienties uitrekent (E=1-(Ï„DA/Ï„D) en zo dus relatieve intensiteiten gaat uitzetten, achteraf gezien wel een simpele oplossing, maar er zijn er maar weinig die dit hadden…)
   • Krijgt ge hetzelfe resultaat als je CY5 en CY5.5 vervangt door 2 DRONPAs? En krijg je hetzelfde resultaat als je beide vervangt door 2KAEDEs? (ANTW: Doordat je vervangt door 2 keer hetzelfde ga je uiteraard niet hetzelfde zien. DRONPA is photoswitchable en zo kan je FRET combineren met aan en uit zetten van DRONPA, KAEDE is photoconverteble en zo kan je FRET combineren met switchen tss 2 kleuren van KAEDE)
7. Hoeveel labels moet een 2µm actinefilament bevatten opdat ge het met 10nm zou kunnen waarnemen? (ANTW: 2000nm/10nm=200  je hebt minstens het dubbel hiervan nodig (400), wnt je wilt weten wat er zich tussen labels dat op 10nm van elkaar staan afspeelt, dus minstens om de 5nm een label zetten)

1 september 2010

Bestand:HIV replication cycle.gif

HIV replication cycle

1. (12 punten) Afbeelding HIV replicatieyclus gegeven. Bedenk experimenten gebaseerd op technieken die we in de cursus gezien hebben (en uiteindelijk ook biochemische technieken) om onderstaande onderzoeksvragen te behandelen. Hoe kan je:
   • docking van het virus visualiseren?
   • bewijzen dat docking al dan niet receptor-gemedieerd is?
   • aantonen of transport van het viraal DNA gebeurt door actief transport of door vrije diffusie?
   • bewijzen dat het viraal DNA door nucleaire poriën wordt getransporteerd?
   • bewijzen dat het viraal DNA geïntegreerd is in het cellulaire DNA?
   • bewijzen dat er nieuwe virale eiwitten worden aangemaakt?
2. (4 punten) Is de volgende bewering correct of niet?: "Voor het bestuderen van moleculaire interacties is FCS een betere techniek dan BiFC." Motiveer je antwoord.
3. (4 punten) Hoe kan men het contrast in lichtmicroscopie verbeteren?

18 januari 2010

1. Hoe kan je DNA sequencen met behulp van raman spectroscopie? Stel een experimentele setup voor.
2. Waar moet je op letten bij fluorescentie in vivo? Wat zijn de problemen, hoe kan je die oplossen? Welke technieken zijn geschikt en wat zijn voordelen/nadelen?
3. Geef manieren om contrast in optische microscopie te verhogen.
4. Signaalpathway gegeven van een G-proteine en adenyl cyclase (in membraan). Hoe kan je de interactie tussen G-proteine en adenyl cyclase onderzoeken? Is dit systeem geschikt voor single molecule? Geef de single molecule time traces.
5. Verschil tussen anti-stokes raman (direct meten) en CARS.
6. Ontwerp een experiment om de toxiciteit van nanoparticles te onderzoeken. Vaak wordt gesuggereerd dat nanoparticles direct interfereren met de celcyclus. Hoe kan je dat onderzoeken?
7. Vraagje over FRAP van membraanproteine. Berekenen van diffusiecoëfficient. (500 nm diameter bleach spot + half recovery op x s gegeven).

15 januari 2010

1. Voordelen van single molecule DNA sequencing? Verschil tussen methode met exonuclease en met polymerase? Methode voor single molecule DNA sequencing zonder fluorescentie? (4 ptn)
2. Bestuderen van protein folding. Vaststellen van 'rare misfolding' en 'folding'? Kinetica van folding en misfolding? Probability van misfolding? Stel een experiment op met de geziene technieken.) (4 ptn)
3. Is het mogelijk om de temperatuur te bepalen met Raman Spectroscopy? (2 ptn)
4. Conformatieveranderingen van <1nm bestuderen (3 ptn)
5. Technieken om single molecules te bestuderen zonder fluo (2 ptn)
6. Bestuderen van de dynamica van actinefilamenten (3 ptn)
7. Foto's van fluo-gekleurde cellen: multi-exposure view, intensiteit, lifetime image: wordt elk fluorofoor correct geïdentificeerd in legende? Hoe werd lifetime image gemaakt? (2 ptn)

30 januari 2009

1. Gegeven een figuur van DNA-sequentie-methode. Een proefopstelling daarvoor tekenen, en karakteristieken van de dyes en de optische componenten geven.
2. Wat is de PSF. Kan je die veranderen? Hoe?
3. Vreemde vraag van halve bladzijde. Kwam er op neer dat ze het zelf nog niet zo goed wisten en dat een E. coli ongeveer de grootte van de focal spot heeft.
4. Drie vraagjes van Visser. Bijna letterlijk.
5. Nog drie vraagjes van Visser. Al bijna even letterlijk.
6. Een polynucleotide (<20nt) is aan de ene kant gemerkt met een dye (MB121 of zo). Er zijn een paar mutaties gemaakt: er werd op bepaalde plaatsen G (dat in de "wt" afwezig was) ingebracht. Resultaat: lifetime vermindert, abs/em niet (rond de 600nm, G zit rond 300nm is gegeven). Wat gebeurt er en hoe kan je het kwantitatief bestuderen?

26 januari 2009

1. Welke methode zou je gebruiken om chaperone gemedieerd folding proces te onderzoeken, bespreek kort de theoratische achtergrond. (FRET) Stel 2 mogelijke labelingsstrategieen voor. Kan dit ook bestudeerd worden via elektron transfer, hoe ziet een single molecule trace er dan uit en dergelijke.
2. Hoe zou je de volgende processen bestuderen: Ca2+ release in cellen, diffusie in membraan, colocalisatie, stoichiometrie.
3. Bespreek de uitspraak 'PALM en STED zijn volledig gebaseerd op hetzelfde principe'
4. Hoe kan je achtergrond/autofluorescentie vermijden of bestrijden? Hoe verhoog je contrast in optische microscopie (wees volledig)
5. Twee kleinere vraagjes over FRET-FRAP experiment met de androgen receptor
6. Drie kleinere vraagjes rond FLIM

18 januari 2008

1. (4punten) De eerste vraag ging over een RET waarbij drie fluorophoren in twee conformaties voorkomen en naargelang de conformatie was er tussen twee van de drie RET en dan moest je daar een diagram van tekenen: Fluorescentie intensiteit ifv de tijd. Als extra moest je dan ook nog eens een diagram tekenen als er RET was tussen alle drie. Bij deze vraag moest je telkens rekening houden met de efficientie van transfer.
2. (3punten) Een schema dat je moest vervolledigen: je kreeg de technieken FCS, FRAP, FCCS en FRET-FLIM en dan moest je bij alle zeggen of je er dynamics mee kon bestuderen, of je naar moleculaire interacties kon kijken, de conc. range die nodig is voor de techniek en de tijdsschaal waarop gekeken wordt.
3. (2punten) Als je met een microscoop met twee kanalen co-localizatie waarneemt, heb je dan interactie tussen beide moleculen?
4. (2punten) We hadden in de les twee artikels behandeld van Sunexie (of zoiets)
   • Waarom wordt het proteine onder de lac promotor tot expressie gebracht?
   • Waarom veranker je YFP aan een membraanproteine?
5. (3punten) Wat is de Point spread function (PSF) in microscopie. Kun je deze veranderen en zoja, hoe?
6. (4punten) Hoe kun je autofluorescentie vermijden/overkomen vanuit het oogpunt van microscopie?
7. (2punten) Je hebt een bepaalde dye die aan het 3' uiteinde van een oligonucleotide wordt gehangen. (dan had je een tabelletje met 4 oligonucleotiden en dan de levensduur van de dye) Als er zich een Guanine in de buurt van de dye komt, dan wordt de levensduur van de dye plots veel korter. Het absorptiemaximum van de dye ligt rond 650nm en het absorptieminimum rond 680. Nucleotiden absorberen enkel op golflengtes kleiner dan 330nm.
   • Van welk proces is hier sprake?
   • Welke quantitatieve informatie kun je hieruit afleiden?</text>